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原文传递一种杜仲含胶细胞原位观测方法

专利名称：	一种杜仲含胶细胞原位观测方法
摘要：	本发明公开了一种杜仲含胶细胞原位观测的方法。该方法包括：新鲜杜仲叶、皮、籽壳经预处理、变性处理、透明处理和封片处理，将封片后的不同组织用于杜仲含胶细胞原位观测。所述预处理包括：新鲜杜仲组织清洗处理，在FAA中的脱气、固定处理。本发明通过对新鲜的杜仲叶、皮、籽壳进行预处理，改善其工艺条件，使得杜仲胶细胞可以不使用石蜡切片或冷冻切片进行原位观察，有效提高杜仲含胶细胞的观测效率，解决切片过程中含胶细胞常破碎不完整的问题，为杜仲含胶细胞的生长发育研究提供新的技术手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	陕西;61
申请人：	西北农林科技大学
发明人：	朱铭强;马学峰;杨鑫;姚雪峰;兰彩宁;迟志振;龙大平;勒晓娜;邱凌;杨选民
专利状态：	有效
申请日期：	2023-09-14T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202311187390.3
公开号：	CN117030412A
分类号：	G01N1/30;G01N1/28;G;G01;G01N;G01N1;G01N1/30;G01N1/28
申请人地址：	712100 陕西省咸阳市杨陵区西农路22号
主权项：	1.一种杜仲含胶细胞原位观测的方法，其特征在于所述方法包括：新鲜的杜仲叶、皮和籽壳经预处理、固定处理、变性处理、脱木素和透明处理、封片处理，使杜仲含胶细胞可以不经切片直接观测；所述预处理包括：新鲜杜仲叶、皮和籽壳需要使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中，使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中；所述固定处理包括：置于FAA溶液中完全没过并在-0.08MPa下保持30分钟，随后密封于阴凉处静置24h；所述变性处理包括：经预处理，固定处理的杜仲叶、皮和籽壳经1M PBS缓冲液冲洗后加入到变性试剂中，密封避光保存48h；所述脱木素和透明处理包括：变性处理后的杜仲叶、皮和籽壳使用1M PBS缓冲液冲洗，置于质量浓度为10%的氢氧化钠、亚硫酸钠溶液中，密封后置于60℃烘箱中保存24~48h，杜仲叶、皮和籽壳应根据材料种类和厚度来调整烘箱中的保存时间，一般杜仲叶保存24h，杜仲皮和籽壳保存48h，若材料不够透明应适当延长时间；所选取的材料面积应小于载玻片的面积，所选取的部位厚度应不超过2mm；1M PBS缓冲液冲洗流速为1.5米/秒~2米/秒；所述封片处理包括：使用甘油明胶封片剂完全包裹载玻片上的样品，并排出气泡；所使用的甘油明胶封片剂使用前须在37~40℃温育，并在完全溶解后使用。 2.根据权利要求1所述的杜仲含胶细胞原位观测的方法，其特征在于：所述的方法具体为：（1）所述预处理包括：所述杜仲原材料包括新鲜杜仲叶、新鲜杜仲皮和新鲜杜仲籽壳；（2）所述固定处理包括：所述预处理包括新鲜杜仲叶、皮和籽壳需要使用超纯水清洗干净，擦干后立即置于FAA固定液中；（3）所述变性处理包括：经所述预处理，所述固定处理的杜仲叶、皮和籽壳经1M PBS缓冲液冲洗后加入到变性试剂中，密封避光保存48h；（4）所述脱木素和透明处理包括：将变性处理后的杜仲叶、皮和籽壳过滤，取完整的组织，使用1M PBS缓冲液冲洗干净，置于氢氧化钠、亚硫酸钠溶液中，密封后置于60℃烘箱中保存24~48h；（5）所述封片处理需要使用甘油明胶封片剂对杜仲组织进行封片，所述甘油明胶封片剂必须在组织未脱水时滴加，滴加量为2~4滴，视组织大小而定。 3.根据权利要求2所述固定处理时需要置于FAA溶液中完全没过并在-0.08MPa下保持30分钟，随后密封于阴凉处静置24h。 4.根据权利要求2所述变形试剂为溴碘冰醋酸溶液，其中饱和溴水45 ml，单质碘2.5g，之后加入冰醋酸至100 ml，搅拌均匀后的溶液；杜仲原材料的体积为固定试剂和变性试剂体积的二十分之一到三十分之一。 5.根据权利要求2所述变性、脱木素和透明处理过程中1M PBS缓冲液冲洗的流速为1米/秒~2米/秒；氢氧化钠、亚硫酸钠溶液质量浓度为5%~10%的混合溶液，杜仲叶、皮和籽壳应根据材料种类和厚度来调整烘箱中的保存时间，一般杜仲叶保存24h，杜仲皮和籽壳保存48h，若材料不够透明应适当延长时间，将经过所述脱木素和透明处理后的杜仲组织，轻轻移至载玻片上，使用1M PBS缓冲液冲洗至pH为中性。 6.根据权利要求3所述固定处理进行抽气处理是为了去除细胞内的空气，加速固定液进入，因为变性试剂、脱木素和透明试剂是高浓度的溶剂，所以新鲜的杜仲树叶，树皮和籽壳不固定的话易发生收缩。 7.根据权利要求5所述选择60℃的透明脱木素温度主要是考虑杜仲组织中的杜仲胶的结晶温度为65℃，在这个温度下处理不会影响杜仲胶的结晶，而温度相对较高可以加快脱木素和透明处理的速度，使用氢氧化钠、亚硫酸钠混合溶液则可以同时实现组织脱木素和透明；在两次冲洗过程中选择1M PBS缓冲液是因为该缓冲液接近细胞内的渗透压，可以较好的保持组织的形态不会发生太大的变化。
所属类别：	发明专利