详情

原文传递 WNV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法

专利名称：	WNV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法
摘要：	本发明公开了一种WNV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，在GFP中插入WNV的NS2B/NS3蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达WNV NS2B/NS3蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成WNV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能够避免使用WNV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL‑1级实验室即可满足实验要求，高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于WNV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江迪福润丝生物科技有限公司
发明人：	方晨捷;毛水花;余飞;武小琰;宋家升
专利状态：	有效
申请日期：	2023-10-20T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-21T00:00:00+0800
申请号：	CN202311361050.8
公开号：	CN117092084A
代理机构：	杭州知见专利代理有限公司
代理人：	赵越剑
分类号：	G01N21/64;C12Q1/37;C12N15/85;C12N15/57;C12N15/62;G;C;G01;C12;G01N;C12Q;C12N;G01N21;C12Q1;C12N15;G01N21/64;C12Q1/37;C12N15/85;C12N15/57;C12N15/62
申请人地址：	310000 浙江省杭州市滨江区长河街道滨安路688号2幢C楼6层601室
主权项：	1.一种WNV蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建共表达改造的GFP和WNV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列而成；（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的GFP和WNV NS2B/NS3蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。 2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点B和位点C；位点B为野生型GFP氨基酸序列第117~118位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。 3. 根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为SGKRSQIG，cut2氨基酸序列为GLKRGGAK。 4. 一种共表达改造的GFP和WNV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，其特征在于，所述质粒包括表达WNV NS2B/NS3蛋白酶的编码基因序列以及表达改造的GFP的编码基因序列；所述改造的GFP为在野生型GFP上插入WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列而成。 5. 根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点B和位点C；位点B为野生型GFP氨基酸序列第117~118位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。 6. 根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为SGKRSQIG，cut2氨基酸序列为GLKRGGAK。 7.一种WNV蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建共表达改造的GFP和WNV NS2B/NS3蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入WNV NS2B/NS3蛋白酶切割序列而成；（2）评价：将待转染细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的GFP和WNV NS2B/NS3蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。
所属类别：	发明专利