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原文传递结核分枝杆菌组合物和方法

专利名称：	结核分枝杆菌组合物和方法
摘要：	本申请描述了用于促进结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)生长并在中性pH(例如6.8)下获得PZA活性的新型营养组合物。这些组合物利用传统上不受欢迎的生长营养物，包括与结核分枝杆菌在体内的持久性(persistence)相关的某些氨基酸、胆固醇、乳酸盐、脂肪酸或铵盐。本申请描述了使用这样的组合物来提供用于PZA敏感性测试的可靠方法，其中，所有的结核病药物敏感性测试都可以整合到有效且经济的系统中。本申请进一步描述了用于结核病治疗的体外PZA类药物的筛选和鉴定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	美国;US
申请人：	石万良
发明人：	石万良
专利状态：	有效
申请日期：	2022-03-18T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-10T00:00:00+0800
申请号：	CN202280023003.X
公开号：	CN117043600A
代理机构：	北京之于行知识产权代理有限公司
代理人：	何志欣
分类号：	G01N33/566;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/566
申请人地址：	美国马里兰州陶森市远山街403号
主权项：	1.一种用于促进结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生长的组合物，所述组合物包含： (i)一种或多种氮源，所述一种或多种氮源单独包含一种或多种氨基酸或其盐，或者，所述一种或多种氮源包含一种或多种氨基酸或其盐和与一种或多种铵盐的组合； (ii)一种或多种碳源，所述一种或多种碳源包含甘油、丁酸、乳酸盐、胆固醇、丙酮酸、右旋糖、柠檬酸或其组合； (iii)一种或多种盐，所述一种或多种盐包含MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、NaH2PO4或其组合；和 (iv)一种或多种补充营养物，所述一种或多种补充营养物包含ZnSO4、盐酸吡哆醇、生物素、吐温80、油酸、白蛋白、柠檬酸铁铵、过氧化氢酶或其组合；其中，所述组合物经配制以支持在35至37℃下在6.2至8.0的起始pH对结核分枝杆菌进行抗生素敏感性测试。 2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述一种或多种氨基酸包含低浓度的天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸。 3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述一种或多种氨基酸包含Ala、Arg、Lys、Ser、Thr、Ile、Gly、His、Pro、Val、Leu、Met、Phe、Tyr或其组合。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种氮源包含选自由乙酸铵、琥珀酸铵、氯化铵、柠檬酸二铵、酒石酸二铵，甲酸铵、硝酸铵及其组合组成的组中的一种或多种铵盐。 5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种碳源包含甘油、柠檬酸、胆固醇、丁酸、乳酸或其组合。 6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种碳源包含胆固醇。 7.一种包含权利要求1至6中任一项所述的组合物的培养基，其中，所述培养基为液体或固体，其中，所述组合物的pH为6.2至8.0。 8.根据权利要求7所述的培养基，其中，所述培养基为液体。 9.根据权利要求7所述的培养基，其中，所述培养基为固体。 10.根据权利要求9所述的培养基，其中，所述固体为琼脂。 11.根据权利要求7至10中任一项所述的培养基，其中所述组合物包含白蛋白。 12.根据权利要求7至11中任一项所述的培养基，其中，所述培养基包含吐温80。 13.根据权利要求7至12中任一项所述的培养基，其中，所述组合物包含白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶。 14.根据权利要求7至13中任一项所述的培养基，其中，所述组合物包含一种或多种抗微生物试剂。 15.根据权利要求7至14中任一项所述的培养基，其中，所述组合物包含pH指示剂。 16.根据权利要求15所述的培养基，其中，所述pH指示剂为酚红。 17.一种用于测定用以治疗结核分枝杆菌感染的抗生素的药物敏感性的方法，所述方法包括： (a)使用结核分枝杆菌的临床测试样品接种包含根据权利要求1至6中任一项所述的组合物的第一培养基； (b)在抗生素存在或不存在的情况下，在足以在不存在所述抗生素的情况下观察到所述测试样品的生长的温度和一段时间的中性pH条件，对经接种的第一培养基进行温育； (c)比较在存在或不存在所述抗生素的情况下所述测试样品的生长；和 (d)基于步骤(c)中的所述比较，确定所述测试样品对所述抗生素是敏感的还是抗性的。 18.根据权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括以下步骤： (a2)使用对所述抗生素敏感的结核分枝杆菌对照样品接种包含权利要求17中的所述组合物的第二培养基； (b2)在存在或不存在所述抗生素的情况下，在足以在不存在所述抗生素的情况下观察到对照样品的生长的温度和一段时间的中性pH条件，对经接种的第二培养基进行温育； (c2)比较在含有所述抗生素的培养基中所述对照样品的生长与所述测试样品的生长；和 (d2)基于步骤(c2)中的比较，确定所述测试样品对所述抗生素是敏感的还是抗性的；其中，所述对照样品存在实质性的生长抑制作用并且所述测试样品不存在实质性的生长抑制作用表明所述测试样品对所述抗生素具有抗性；和其中，所述对照样品和测试样品两者都存在实质性的生长抑制作用表明所述测试样品对所述抗生素是敏感的。 19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述抗生素为吡嗪酰胺。 20.根据权利要求19所述的方法，其中，吡嗪酰胺以5μg/ml至1000μg/ml的浓度存在于所述培养基中。 21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，所述方法还包括测定所述抗生素的最小抑制浓度的步骤。 22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中，所述测试样品在存在所述抗生素的情况下的生长小于在不存在所述抗生素的情况下所述抗生素的预先确立的耐药性水平表明所述测试样本对所述抗生素具有敏感性。 23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中，所述抗生素选自由吡嗪酰胺、利福平、利福喷丁、异烟肼、乙胺丁醇、贝达喹啉、利奈唑胺、莫西沙星、德拉马尼(Delamanid)、普瑞马尼(pretomanid)、阿米卡星、氯苯吩嗪、环丝氨酸、利福布汀、左氧氟沙星、乙酰胺、对氨基水杨酸；链霉素和氟喹诺酮组成的组。 24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述抗生素为吡唑酰胺、利福平、异烟肼或乙胺丁醇。 25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述抗生素为吡嗪酰胺。 26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中，每种经接种的培养基在6.2至8.0的起始pH下温育。 27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中，每种经接种的培养基在35至37℃温育。 28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中，所述第一培养基和所述第二培养基中的每一种培养基都是液体的。 29.根据权利要求28中任一项所述的方法，其中，所述方法通过肉汤微量稀释法进行。 30.根据权利要求28中任一项所述的方法，其中，所述方法通过肉汤大量稀释法进行。 31.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中，所述第一培养基和所述第二培养基中的每一种都是固体。 32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述固体为琼脂。 33.根据权利要求31或32所述的方法，其中，所述方法通过琼脂比例法进行。 34.根据权利要求17至33中任一项所述的方法，其中，所述组合物包含白蛋白。 35.根据权利要求17至33中任一项所述的培养基，其中，所述组合物包含吐温80。 36.根据权利要求17至33中任一项所述的培养基，其中，所述组合物包含白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶。 37.根据权利要求17至36中任一项所述的培养基，其中，所述组合物包含一种或多种抗微生物试剂。 38.根据权利要求17至37中任一项所述的方法，其中，所述组合物包含pH指示剂。 39.根据权利要求38所述的培养基，其中，所述pH指示剂为酚红。 40.一种筛选多种测试化合物抑制结核分枝杆菌生长的能力的方法，所述方法包括以下步骤： (a)使用结核分枝杆菌分离物接种包含根据权利要求1至6中任一项所述的组合物的培养物，以形成对照培养物； (b)对包含步骤(a)中的所述结核分枝杆菌的多个次级培养物进行平行接种，以形成多个测试培养物，其中，所述多个测试培养物中的每一种测试培养物在包含在步骤(a)中的所述组合物的所述培养基中包含不同的测试化合物； (c)对所述第一培养物和所述测试培养物进行平行温育，所述平行温育在足以在步骤(b)中不存在所述不同测试化合物的情况下观察到所述对照样品的生长的温度和一段时间的中性pH条件进行； (d)比较所述结核分枝杆菌分离物在所述测试化合物存在或不存在的情况下的生长；和 (e)基于步骤(d)中的比较，确定一种或多种所述测试化合物是否抑制所述结核分枝杆菌分离物的生长。 41.根据权利要求40所述的方法，其中，步骤(d)中的所述比较包括鉴定被相应的测试化合物抑制生长的一种或多种次级培养物。 42.根据权利要求40或41所述的方法，其中，每种所述培养基包含pH指示剂，并且其中，步骤(d)中的所述比较包括检测测试培养物生长后所述培养基的颜色变化。 43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述颜色变化由板读仪检测。 44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中，所述方法通过肉汤微量稀释测定法进行。 45.根据权利要求40至44中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述次级培养物包含已知抑制所述结核分枝杆菌分离物生长的抗生素。 46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述抗生素选自由吡嗪酰胺、利福平、利福喷丁、异烟肼、乙胺丁醇、贝达喹啉、利奈唑胺、莫西沙星、德拉马尼(Delamanid)、普瑞马尼(pretomanid)、阿米卡星、氯苯吩嗪、环丝氨酸、利福布汀、左氧氟沙星、乙酰胺、对氨基水杨酸、链霉素和氟喹诺酮组成的组。 47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中，所述培养基中的每种培养物被置于微量滴定板的板孔中。 48.根据权利要求40至47中任一项所述的方法，其中，已被发现抑制结核分枝杆菌生长的一种或多种测试化合物在存在或不存在不同浓度的所述一种或几种测试化合物的情况下温育，并且其中，测定一种或多种所述测试化合物的最小抑制浓度(MIC)，其中，所述MIC对应于所述测试化合物的抑制结核分枝杆菌可见生长的最低浓度。 49.一种用于治疗或预防结核病的药物组合物，所述药物组合物包含表12中给出的化合物与药学上可接受的载体的组合。 50.一种治疗或预防结核病的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的权利要求49所述的组合物。 51.根据权利要求50所述的方法，所述方法进一步包括施用第二抗结核病试剂。 52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述第二抗结核病试剂选自由吡嗪酰胺、利福平、利福喷丁、异烟肼、乙胺丁醇、贝达喹啉、利奈唑胺、莫西沙星、德拉马尼(Delamanid)、普瑞马尼(pretomanid)、阿米卡星、氯苯吩嗪、环丝氨酸、利福布汀、左氧氟沙星、乙酰胺、对氨基水杨酸、链霉素和氟喹诺酮组成的组。
所属类别：	发明专利