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原文传递基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法

专利名称：	基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法
摘要：	本申请涉及水稻病原检测领域，具体涉及基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法。为了解决两种病害因其前期症状相似，在农业生产上较难区分，难以精准施药和检疫检验的技术问题。本申请利用拉曼光谱快速、无损、无惧水及微区分辨的特性，采用共聚焦显微拉曼光谱仪结合卷积神经网络，建立水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病两种病原细菌的拉曼光谱信息，开发出快速的检测鉴定方法，为农业和检疫部门提供可选的技术支持和科学保障。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国农业大学
发明人：	徐宁;付钰;刘俊;纪雪晗;薛俊静;卢维来;董峰;张贤玉
专利状态：	有效
申请日期：	2023-07-31T00:00:00+0800
发布日期：	2023-11-07T00:00:00+0800
申请号：	CN202310943958.3
公开号：	CN117007575A
代理机构：	北京知文通达知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	欧阳石文
分类号：	G01N21/65;G06V20/10;G06V10/764;G06V10/77;G06V10/82;G06N3/0464;G06N3/08;G;G01;G06;G01N;G06V;G06N;G01N21;G06V20;G06V10;G06N3;G01N21/65;G06V20/10;G06V10/764;G06V10/77;G06V10/82;G06N3/0464;G06N3/08
申请人地址：	100193 北京市海淀区圆明园西路2号
主权项：	1.基于拉曼光谱的水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备检测样本：制备待测菌液；（2）采集光谱：采用共聚焦显微拉曼光谱仪采集光谱；（3）基于拉曼光谱，确定所述病原的种类，确定水稻感染的细菌性病害是水稻白叶枯还是水稻细菌性条斑病病原。 2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测菌液的制备是剪取待测的发病叶段，将发病叶段的发病一端浸没在生理盐水中，得到待测菌液；优选地，将5-6片发病叶段的发病一端浸没在生理盐水中8-15min，得到待测菌液。 3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测菌液的制备是取待测发病水稻叶片分离病原菌后，在培养基中划线接种，置于恒温培养箱中培养，待培养基上长出单克隆菌落；将菌种放置在28℃恒温摇床中振荡孵育16-20 h得到培养菌液，经离心和重悬步骤，并调整至1.0×107-9CFUmL-1即得待测菌液。 4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述离心和重悬步骤具体如下：将培养菌液在常温下离心，去除上清液，用等体积的10 mM MgCl2重悬，相同条件下离心洗涤3次，去除残留培养基；所述步骤（3）的孵育为在室温下孵育30 min，待测菌液调整的浓度为1.0×108 CFUmL-1。 5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在菌液中加入SERS增强基底混匀后进行检测，更具体地，在菌液中加入等体积SERS增强基底并用涡旋仪振荡混匀，在室温下孵育30 min；优选地，所述SERS增强基底是成纳米AgNPs；所述采集光谱时将所述菌液与所述SERS增强基底孵育后的混合液滴加在洁净的铝箔表面，室温干燥后进行检测。 6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述采集光谱，包括对拉曼光谱数据进行预处理和数据处理步骤。 7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述预处理为首先将原始拉曼光谱转化为ASCΠ文件，用原始拉曼光谱减去背景溶液光谱后，使用Savitzky-Golay filtering算法对数据平滑降噪处理，再应用多项式拟合对光谱进行基线校正，最后用最大-最小标准化算法实现光谱数据的标准化，将得到的拉曼光谱使用Z-score算法进行质量筛选，将筛选出的偏离光谱应用K-Means聚类算法筛除宇宙射线，对其进行临近平均值“磨平”处理，完成质控，获得预处理的拉曼光谱。 8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述数据处理步骤为：使用降维方式对数据进行可视化，具体是采用t-分布随机邻近嵌入t-SNE、统一流行逼近与投影UMAP或主成分分析PCA聚类方法。 9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，进一步采用深度学习中的卷积神经网络算法实现对水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原的鉴定。 10.如权利要求1至9任一项所述的检测方法，其特征在于，鉴定水稻白叶枯及水稻细菌性条斑病病原的具体方式如下：（1）CNN模型建立：通过微生物单细胞激光光镊拉曼光谱分析平台，分别采集Xoc、Xoo的拉曼光谱数据，建立CNN模型，对Xoc和Xoo进行分类；具体地，CNN模型在预测病原菌单细胞时通过被赋予不同权重的拉曼峰，实现Xoc、Xoo的识别，通过微生物单细胞激光光镊拉曼光谱分析平台采集到的Xoc、Xoo的拉曼光谱建立的CNN模型，来对Xoc和Xoo进行分类；在后续对Xoc和Xoo再次进行检测时，根据CNN模型的分类结果即可自动判别病原菌的类型（2）病原鉴定：对病原进行检测，根据CNN模型中不同权重的拉曼峰，判别病原菌的类型；其中，CNN是通过建立卷积层和池化层的前向传播，模拟人脑神经元传递的算法，通过卷积层高效提取光谱数据中的局部特征，池化层具有数据特征筛选作用，全连接层将拉曼光谱的特征信息映射到物种的标记空间；根据拉曼光谱数据特点构建 1D 的CNN模型，因此卷积神经网络能够提取每个物种的拉曼光谱的强度特征及其光谱曲率变化特征。
所属类别：	发明专利