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高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法
| 专利名称： | 高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法 |
| 摘要： | 本发明公开一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，是利用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆了全长glmU基因，并对全glmU基因进行改造，只保留编码葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的基因片段，同时建立了高表达葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的大肠杆菌工程菌株。利用亲和层析技术从工程菌株中纯化得到葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，建立了快速、准确测定葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性的方法，该酶活性测定方法是筛选葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的分子模型，用于高通量筛选组合化合物库、中药及天然产物的结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 辽宁;21 |
| 申请人： | 大连医科大学 |
| 发明人： | 马郁芳;辛毅;周妍;张文利 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2009-11-26T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN200910220162.5 |
| 公开号： | CN101942501A |
| 代理机构： | 大连非凡专利事务所 21220 |
| 代理人： | 闪红霞 |
| 分类号： | C12Q1/68(2006.01)I |
| 申请人地址： | 116044 辽宁省大连市旅顺口区南路西段9号 |
| 主权项： | 一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺?1?磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆glmU基因，从glmU基因的5’端进行DNA序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU?C；b.将基因片段glmU?C克隆到pET载体，构建出pET?glmU?C表达载体；c.将pET?glmU?C表达载体转化到大肠杆菌中，构建出表达葡糖胺?1?磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia?coli?MTGC08)，保藏编号CGMCC3419；d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养4小时，用浓度为0.2mM的IPTG进行诱导；e.收获细菌，破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸?Ni2+亲和层析技术纯化得到GlmU?C蛋白；f.将2ug?GlmU?C蛋白与pH?7.5的50mM?Tris?HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺?1?磷酸构成50μl的酶促反应体系，将被筛选物按0.1～5ug/ml浓度加入酶促反应体系中，在30℃孵育5分钟，加入50μl?6M盐酸胍终止反应，再加入50μl?DTNB显色剂显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测得的GlmU?C蛋白在405nm处的标准吸光度值进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖胺?1?磷酸乙酰基转移酶抑制剂。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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