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原文传递基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法

专利名称：	基于量子点共振能量转移检测HBV DNA及单碱基突变的方法
摘要：	本发明涉及一种基于量子点共振能量转移检测HBV?DNA及单碱基突变的方法，包括：巯基丙酸MPA包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备；HBV?DNA检测探针的设计及合成；QDs-DNA探针交联物的制备；HBV?DNA临床样本的制备；使用酶标仪对互补的及单碱基突变的HBV靶DNA的高通量检测。该方法操作简单，不需要对杂交体系中未联接的DNA进行分离纯化；由于Cy5在所选的激发光(485nm)下不会直接产生荧光信号，因此背景干扰小，信号强；该方法还具有特异、快速、高分辨率、高灵敏度和高通量的特点，可应用于临床医学中HBV?DNA及单碱基突变的高通量和多靶标的检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	中国科学院上海微系统与信息技术研究所;华东理工大学
发明人：	毛红菊;王祥;钟新华;赵建龙;金庆辉
专利状态：	有效
申请日期：	2010-01-03T00:00:00+0800
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201010003047.5
公开号：	CN101993956A
代理机构：	上海泰能知识产权代理事务所 31233
代理人：	黄志达;宋缨
分类号：	C12Q1/70(2006.01)I
申请人地址：	200050 上海市长宁区长宁路865号
主权项：	一种基于量子点共振能量转移检测HBV?DNA及单碱基突变的方法，包括：(一)检测探针的制备及HBV?DNA临床样本的制备(1)巯基丙酸包裹的CdSe/ZnS核/壳结构量子点的制备取0.5mL荧光发射峰为575～615nm的三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/ZnS核/壳结构QDs的甲苯溶液，加入2～4mL氯仿，再逐滴加入2～4mL巯基丙酸MPA溶液，室温搅拌30～60分钟，加入5～8mL水，反复震荡，分去有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的QDs溶于Milli?Q超纯水中，制备得到MPA包裹的水溶性CdSe/ZnS?QDs；(2)HBV?DNA扩增引物及检测探针的设计合成PCR扩增引物：PCR上游引物：5’?ACGACCGACCTTGAGGCATACTTC?3’；PCR下游引物：5’?CAGAGCAGAGGCGGTGTCG?3’；检测探针：?NH2修饰的单链DNA探针：5’?TGG?ATG?ATG?TGG?TAT(T)10(CH2)3?(NH2)?3’；?Cy5标记的信号DNA探针?1：5’?Cy5?TGG?CTT?TCA?GTT?ATA?3’；?Cy5标记的信号DNA探针?2：5’?Cy5?TGG?CTT?TCA?GTT?ATG?3’；(3)QDs?DNA探针交联物的制备将0.5g/L的1?乙基?3?(3?二甲基氨丙基)?碳化二亚胺EDC、0.5g/L的N?羟基琥珀酰亚胺NHS和0.05μM的MPA包裹的QDs按体积比为1～2∶1～2∶2～6的比例混合，活化0.5～2小时，然后加入上述?NH2功能化修饰过的单链DNA探针，于37℃孵化0.5～2小时，制备得到QDs?DNA探针交联物；(4)HBV?DNA临床样本的制备采用裂解法抽提阳性血清样品中HBV基因组DNA，然后对HBV?DNA进行PCR扩增，制得HBV?DNA临床待测样本；(二)使用酶标仪对互补靶HBV?DNA及单碱基突变的检测(1)互补靶HBV?DNA及单碱基突变的检测将10μL的HBV?DNA的PCR待测样本加入到115μL(20mM)的Taq联接缓冲液中，在PCR仪上经95℃变性5分钟，使其解为单链；随后将该混合液放入到冰箱中，于冰水中冰浴5分钟；然后向该混合液中加入70μL上述(一)/(3)中的QDs?DNA探针、10μL的Cy5标记的信号探针?1(10μM)、5μL(1个单位)的Taq?DNA联接酶；将该混合液共210μL于42℃下反应15～30分钟，在联接反应完成后，将该反应混合液于Eppendorf?PCR仪上在85℃下加热变性5分钟，使双链解离变为单链；变性后，立即将反应混合液置于冰水中冰浴5分钟；冰浴后将反应混合液迅速转移至96孔板酶标仪中，在Wallac?1420型酶标仪上采用485nm光激发，检测杂交反应液670nm处的荧光发射强度，从而实现对完全互补的或单碱基突变的HBV?DNA临床样本的检测；(2)互补靶HBV?DNA及单碱基突变检测的结果判断①基于QDs?Cy5荧光共振能量转移的HBV?DNA野生型的定量检测将上述(二)/(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若上述(1)中670nm处的荧光发射强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBV?DNA未发生突变，即为野生型，这时可将该样本于670nm处的荧光发射强度与标准曲线进行对比，可以确定样本中HBV?DNA的浓度，从而实现了对野生型HBV?DNA的定量检测；②基于QDs?Cy5荧光共振能量转移的HBV?DNA单碱基突变的检测将上述(1)中670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度与空白噪声的荧光强度相当，则判断该样本中的HBV?DNA发生了单碱基突变；③HBV单碱基突变样本的突变类型的判断替换步骤(二)/(1)中的待测样本为上述②中的HBV?DNA的单碱基突变样本，并将该步骤中的Cy5标记的信号探针?1替换为Cy5标记的信号探针?2，其他方法相同进行检测；将突变样本于670nm处荧光发射强度的检测结果与不加PCR待测样本的空白试样的检测结果进行对比，若样本的荧光强度比空白试样有明显增强，则判断该样本中的HBVDNA发生了YVDD突变，反之则为其他突变。
所属类别：	发明专利