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原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒
| 专利名称： | 原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒 |
| 摘要： | 本发明公开了一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法及试剂盒。本发明根据结核分枝杆菌gyrB基因保守区设计了四条特异性引物，应用这四条引物，同时结合原位荧光环介导恒温核酸扩增技术，能特异性地检测出结核分枝杆菌。本发明实现样品原位检测、无需增菌、特异性高，能在不到2小时完成扩增，最低检测极限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99％。使用本发明所述的方法和试剂盒鉴定结核分支杆菌简便。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 广东;44 |
| 申请人： | 华南理工大学 |
| 发明人： | 叶宇鑫;石磊 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2010-08-20T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201010259678.3 |
| 公开号： | CN101942511A |
| 代理机构： | 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 |
| 代理人： | 裘晖 |
| 分类号： | C12Q1/68(2006.01)I |
| 申请人地址： | 510640 广东省广州市天河区五山路381号 |
| 主权项： | 一种原位荧光环介导恒温核酸扩增技术检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计引物：设计外引物1对和内引物1对，具体为：外引物1：5’?CAGCACGCTAATTACCCGG?3’；外引物2：5’?CGAGTTTGGTCATCAGCCG?3’；内引物1：5’?TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT?3’；内引物2：5’?Cy3?CTGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG?3’；(2)对被检样品进行处理：A、将被检样品中的菌体进行固定；B、增加固定后的菌体的细胞壁通透性；(3)环介导等温扩增反应：A、反应体系为：每25μl反应体系含有10pmol外引物1、10pmol外引物2、10pmol内引物1、10pmol内引物2、8单位Bst?DNA聚合酶和12.5微升LAMP反应缓冲液，双蒸去离子水补至25μl；所述LAMP反应缓冲液为10mM?dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mMMgSO4和5mM?Betina按体积比8∶5∶2∶10配制；B、反应条件为：将配制好的反应体系滴加到步骤(2)处理好的菌体上，聚酯封层，63℃恒温反应2h；(4)样品复染：反应结束后，用4′，6?二脒基?2?苯基吲哚染色，然后用无菌水中漂洗，晾干；(5)分析判断反应产物结果：置于荧光显微镜下观察，打开绿色光，在视野中看到激发红色荧光的细胞就是阳性结果，反之，绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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