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一种用环介导等温扩增技术检测海水淋巴囊肿病毒的方法
| 专利名称： | 一种用环介导等温扩增技术检测海水淋巴囊肿病毒的方法 |
| 摘要： | 本发明涉及一种用环介导等温扩增技术检测海水淋巴囊肿病毒的方法，属于水体病原体 污染检测领域。主要技术方案是利用LAMP技术，针对淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白基因，设 计七条高特异性引物，并通过过滤浓缩水样富集病毒，达到高效特异性检测水样中淋巴囊肿 病毒的目的。与传统方法相比，该方法所需设备和操作步骤简单，特异性强，操作方便，设 备简单，可以快速、准确地鉴定特异的目标病原体。它用环介导等温扩增方法扩增病毒特异 性靶基因，避免了冗长的一系列生化反应，节约时间、劳动力和成本。LAMP鉴定方法不受病 毒生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 天津;12 |
| 申请人： | 南开大学 |
| 发明人： | 黄熙泰;许晶晶;郑泽军;李永君 |
| 专利状态： | 有效 |
| 申请日期： | 2009-06-15T00:00:00+0800 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN200910069251.4 |
| 公开号： | CN101608243 |
| 分类号： | C12Q1/70(2006.01)I |
| 申请人地址： | 300071天津市南开卫津路94号 |
| 主权项： | 1.一种用环介导等温扩增技术检测海水中淋巴囊肿病毒的方法，其特征在于，该方法的 检测步骤如下： (1)设计用于LAMP扩增的特异性寡核苷酸引物 lvFIP1：5’GTATCCGCACCATATAGATGTTTTTAGCGCTATTATACATATACC 3’ lvFIP2：5’GATTCCGCACCATATAGATGTTTTATCACTTGTGTAGCCGGTTC 3’ lvBIP：5’TCTACGTGCTTCAGTATATTACCTTTTATTCTTGTTCATAATTAGGTG 3’ lvF3：5’TATCACTTGTGAAGCGCGTTC 3’ lvB3：5’ATTCGCTCCGTCAACGAAGC 3’ lvIF：5’GCCCTATTATACATTTAGG 3’ lvIB：5’CGAACATAATAAGGTACACC 3’ (2)DNA抽提 1)取10L养殖海水，用0.45μm孔径滤膜过滤，去除细菌细胞。 2)用截留分子量为100kD的小型超滤装置，将10L除菌海水浓缩到200mL。 3)用Centricon plus-70超滤离心管离心(5000r/min，5min)处理，将上述200mL 含有病毒的水进一步浓缩到0.5mL。 4)将上述0.5mL浓缩海水在沸水中煮5min，然后冰浴2min，置-20℃保存备用。 (3)环介导等温扩增(LAMP) 1)LAMP反应体系 在PCR试剂管内加入下列试剂，使总体积为25μL： 成分 体系中各组分终浓度和体积 10×反应缓冲液 2.5μL Bst DNA聚合酶 8U(1μL) lvFIP1(LAMP1)/lvFIP2(LAMP2) 40pmol(4μL) lvBIP 40pmol(4μL) lvF3 5pmol(0.5μL) lvB3 5pmol(0.5μL) lvIF 5pmol(0.5μL) lvIB 5pmol(0.5μL) dNTPs 10mmol/L(0.5μL) DNA样品 50ng 双蒸水 10μL 10×反应缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L (NH4)2SO4，20mmol/L MgSO4，1％Triton X-100) 2)LAMP扩增程序 ①将模板DNA 95℃变性5分钟，立即插到冰上； ②62℃保持60分钟； ③80℃保持2分钟。 (4)LAMP扩增产物检测 1)电泳检查 LAMP产物用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙啶染色，在紫外分析仪下观察， 阳性结果条带呈梯状分布，间距50bp左右。 2)荧光染料SYBR Green I染色后观察判定 在LAMP扩增产物中加入0.5μL的10×SYBR Green I荧光染料浓缩液，通过肉眼观察。 阳性样本显绿色，阴性样本显橙黄色。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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