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原文传递寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法

专利名称：	寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法
摘要：	本发明公开了一种寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，包括下述步骤：对青霉素生产过程中产黄青霉菌细胞内的小分子代谢物进行测定；将各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；用Markerlynx软件对标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；利用本发明的方法可以快速地、准确地将青霉素发酵过程的生物标志物寻找出来，这些生物标志物为青霉菌代谢路径的改造提供靶点，从而为进一步获得高产菌株，提高青霉素产量提供理论基础。同时也为其他抗生素等生产菌的改造提供新的思路和方法。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	天津;12
申请人：	天津大学
发明人：	元英进;丁明珠;乔斌;江靖;卢华;陈尧
专利状态：	有效
申请日期：	2010-09-13T00:00:00+0800
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201010279863.9
公开号：	CN101936971A
代理机构：	天津市北洋有限责任专利代理事务所 12201
代理人：	陆艺
分类号：	G01N30/72(2006.01)I
申请人地址：	300072 天津市南开区卫津路92号天津大学
主权项：	寻找青霉素发酵过程的生物标志物的方法，其特征是包括下述步骤：(1)对青霉素生产过程中产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)CGMCC No 3.4023细胞内的小分子代谢物进行测定：①产黄青霉菌细胞收集及萃灭：在产黄青霉菌发酵过程的前期、中期和后期的各期中任选3 4个时间点，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮萃灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞；②提取小分子代谢物：取步骤①获得的破碎细胞20 100mg置于离心管中，加入0.5 2.0ml 40℃保存的体积浓度为50％的甲醇水溶液为提取液，并加入10μl 20μl的0.14mg/ml氘标记的丁二酸为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融2 4次，每次冻0.5 3.0min；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50％的甲醇水溶液为提取液0.5 2.0ml，混合均匀，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混匀，并冷冻干燥；③衍生化：向步骤②获得的冻干的样品中加入40 60μl的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，30 40℃水浴，进行肟化反应60 100min；再加入50 100μl的N 甲基 N 三甲基硅烷三氟乙酰胺，35 40℃水浴，进行硅烷化反应30 80min；④用气相色谱飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：将1μl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB 5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃ 280℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始50℃ 80℃保持2min 5min，以4℃/min 8℃/min的速度升到260℃ 300℃，保持3min 8min，使用EI电离源，源温230℃ 260℃，检测器电压2300V 2700V，电离电压60eV 80eV，电流30μA 50μA；质谱检测范围50 800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到青霉素发酵过程中产黄青霉菌细胞内各个小分子代谢物的相对含量；(2)主成分分析：①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；②用Markerlynx软件对步骤(2)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来寻找产黄青霉菌的青霉素生产过程中细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在产黄青霉菌的青霉素生产过程中的变化就越大，便可作为青霉素发酵过程的生物标志物。
所属类别：	发明专利