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原文传递抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途

专利名称：	抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途
摘要：	本发明公开了一种抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法及其用途。本发明选取氟喹诺酮类药物中的六种药物，分别与载体蛋白牛血清白蛋白偶联合成免疫抗原，混和六种免疫抗原采用背部皮下注射免疫兔子，经过杂交瘤技术，最终得到抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体。本发明制备的抗体为兔单克隆抗体，兔单克隆的制备优于鼠单克隆抗体。兔子相比于小鼠可以识别更多免疫抗原的表位。其次，兔脾脏较大可以进行更多的融合实验，使高通量筛选融合细胞成为可能。本发明的抗氟喹诺酮类抗体对恩诺沙星、氧氟沙星、二氟沙星、培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星等氟喹诺酮类药物都有很好的检测效果，具有广谱性。可用于食品、饲料及环境样品中的氟喹诺酮类药物的残留检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	郑晓冬;刘娜;陆蕾;倪庚
专利状态：	有效
申请日期：	2010-10-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201010514181.1
公开号：	CN101983971A
代理机构：	杭州求是专利事务所有限公司 33200
代理人：	张法高
分类号：	C07K16/44(2006.01)I
申请人地址：	310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号
主权项：	抗氟喹诺酮类兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于它的步骤如下：1)将30mg环丙沙星、45mgN?羟基琥珀酰亚胺和150mg碳二亚胺盐酸溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中，避光搅拌反应24h，得到环丙沙星反应液；将牛血清白蛋白100mg，溶解于15mL磷酸盐缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将环丙沙星反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应3h，用磷酸盐缓冲液透析，得到环丙沙星免疫抗原，?20℃存放；氧氟沙星免疫抗原、恩诺沙星免疫抗原与环丙沙星免疫抗原合成方法相同；2)将氟甲喹40mg溶解于1ml的二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应20分钟，得到氟甲喹溶液反应液；将80mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH9.6碳酸缓冲液中，得到牛血清白蛋白溶液，将氟甲喹溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到氟甲喹免疫抗原，?20℃保存；3)将达氟沙星40mg溶解于3ml二甲基甲酰胺和1ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，暗处反应60分钟，得到达氟沙星溶液反应液；将60mg牛血清白蛋白溶解于8mlpH?9.6碳酸缓冲液，得到牛血清白蛋白溶液，将达氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，磁力搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到达氟沙星免疫抗原，?20℃保存；4)将诺氟沙星40mg溶解于2ml二甲基甲酰胺和2ml二氧六环中，4℃预冷后，加入30μl三丁胺，冰浴10分钟后加入40μl氯甲酸异丁酯，反应60分钟，得到诺氟沙星溶液反应液；将100mg牛血清白蛋白、167mg碳二亚胺盐酸、167mg?N?羟基琥珀酰亚胺溶解于8ml去离子水中，再加入2ml乙二胺，4℃反应12h，得到牛血清白蛋白溶液；将诺氟沙星溶液反应液滴加到牛血清白蛋白溶液中，搅拌反应4h，用磷酸盐缓冲液透析，得到诺氟沙星免疫抗原，?20℃保存；5)将上述合成的六种免疫抗原，采用背部皮下注射混和免疫兔子，免疫前取血2ml，第一次免疫将六种免疫抗原各0.5mg与等量弗氏完全佐剂混和后进行免疫，第二次至第五次免疫将六种免疫抗原各0.25mg与等量弗氏不完全佐剂混和后进行免疫，免疫间隔两周，加强免疫安排在第五次免疫后的4?8周内，将六种免疫抗原各0.5mg混和后静脉注射，注射后4天杀兔子，取脾备用；6)无菌取脾脏，分离脾脏细胞，分离脾脏细胞的步骤为：在培养皿中去除脾脏周围的脂肪和其他组织；用1640培养液冲洗后，将脾脏置于不锈钢筛网上，挤压过筛；用1640培养液悬浮后离心，1400rpm，5min；弃上清，重复洗涤一次；用1640培养液重悬细胞，取少量细胞悬液稀释；用台盼蓝染色计算活细胞数；根据细胞计数，取含2×108个脾淋巴细胞的悬液备用；7)将脾脏细胞与240E细胞进行细胞融合，240E细胞是在细胞融合实验前一周传代培养的，融合当天收集生长旺盛、正处于对数生长期的240E细胞与免疫兔子的脾细胞融合，融合剂为50％的聚乙二醇，细胞融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照；8)融合后的细胞用HAT作为选择性培养基，分装于加有饲养细胞的40块96孔细胞培养板中，置37℃、6％CO2培养箱内培养，2?3周初检，取细胞培养孔上清，用间接ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用有限稀释法进行克隆化，每个多克隆分装于3块96孔细胞培养板中，三周后用间接ELISA法筛选出阳性克隆，每个多克隆选大于3个阳性孔，转移至24孔细胞培养板中，一周后，采用间接ELISA法、间接竞争ELISA法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存一份，一份用于扩大培养生产氟喹诺酮类兔单克隆抗体；
所属类别：	发明专利