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原文传递 透明质酸高通量微量快速检测方法
专利名称: 透明质酸高通量微量快速检测方法
摘要: 透明质酸(HA)是一种由糖醛酸和葡糖胺为双糖结构的大型多糖,其自然产品和合成产品已广泛应用于临床治疗、制药、生物材料以及化妆品行业。研究发现,体内组织液中HA的浓度变化与一些病理生理状态相关,例如:类风湿、肝病和某些肿瘤患者组织液HA有显著变化。本发明用96孔板进行化学呈色反应,红紫色反应产物在530nm处有最大吸收,可用酶标仪检测,反应产物的呈色深浅及其OD值和HA浓度相关。本发明建立了HA浓度与OD值的标准曲线,并用其计算生物样品中HA的含量。本发明的特点是所需样品微量(10‑20μL)、样本数大、耗材少耗时短易操作。本发明适用于药品、生物材料和化妆品中HA含量测定,也可用于人、大鼠等的组织液或细胞液中HA浓度的体外快速测定。
专利类型: 发明专利
国家地区组织代码: 江苏;32
申请人: 常州大学
发明人: 周晓鹰;魏涛
专利状态: 有效
发布日期: 2019-01-01T00:00:00+0800
申请号: CN201810052414.7
公开号: CN108562574A
分类号: G01N21/78(2006.01)I;G01N21/31(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N21;G01N21/78;G01N21/31
申请人地址: 213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号
主权项: 1.一种涉及到透明质酸(hyaluronic acid,HA)定量快速检测方法,特点在于本方法区别于传统行业标准的紫外分光光度计方法,本专利是关于建立一个使用酶标仪于530nm处进行吸光度(OD值)检测的高通量微量快速方法,步骤如下:A.准备工作:a.配制0.125%咔唑乙醇溶液和0.025M四硼酸钠硫酸溶液;b.HA标准品准备称取适量医用级HA,加入双蒸水稀释,配制成10mg/mL;B.制备HA标准液系列(梯度稀释法)制备HA浓度为0,0.078,0.156,0.312,0.625,1.25,2.50,5.00,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0,100,200,400,800,1600,3200,6400μg/mL系列标准液(注意:传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308‑透明质酸钠含量测定》中标准液使用葡萄糖醛酸,其系列浓度为0,10.0,20.0,30.0,40.0,50.0μg/mL)。C.微孔(96孔板)快速反应酶标仪检测,即高通量法的建立并和传统法比较a.传统法对照:15mL试管反应产物/紫外分光光度计检测(传统法)参照传统法《中华人民共和国医药行业标准YY0308‑透明质酸钠含量测定》所述方法用试管进行实验,分别取1mL各标准液于各试管中,标记,置于冰水浴中,各管缓慢加5mL0.025M四硼酸钠硫酸溶液,摇匀,95℃水浴15min后冰水浴迅速冷却,各管加0.2mL 0.125%咔唑乙醇溶液,摇匀后95℃水浴15min,冷却至室温。以浓度为0的试管作对照,用紫外分光光度计和比色皿(3mL)测定530nm处的吸光度,每测一个浓度都需要更换比色皿。b.半传统法对照:15mL试管反应产物/酶标仪检测分别取100μL上述在试管中反应的液体,置于微孔(96孔板)中,用酶标仪测定530nm处的吸光度。c.微量高通量法(本专利):微孔(96孔板)反应产物/酶标仪检测(高通量法)96孔板,分别取20μL各系列浓度的标准液于微孔中,置于冰上;缓慢加100μL 0.025M四硼酸钠硫酸溶液于各孔中混匀;95℃水浴15min后置于冰上将反应物迅速冷却;各孔再加4μL 0.125%咔唑乙醇溶液混匀,95℃水浴15min后,冷却至室温。用酶标仪在530nm处测定吸光度,并以标准HA浓度(横坐标)对相应的吸光度(纵坐标)作标准曲线。检测样品则按标准曲线给出的公式计算样品HA浓度。D.HA微量高通量法的灵敏度和重复性测试重复9次以上HA系列标准浓度微量反应和吸光度的酶标仪检测,使用分析软件GraphPad Prism 7以标准液浓度对相应的OD值作图,并作数据处理,用平均值±标准偏差表示。计算本检测方法的灵敏度(最低检测限lower limit concentration,LLC)和重复性(变异系数the coefficient of variation,CV%)。CV值不大于10%,则检测方法视为可重复。E.应用实例使用本申请建立的方法,检测了类风湿大鼠模型中免疫前和免疫后大鼠滑膜液HA水平的变化,并发现该HA水平的变化与类风湿病变进程相关。另外,使用本申请建立的方法,检测了某品牌面膜中HA的含量。
所属类别: 发明专利
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