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原文传递一种利用RNA核酸适配体及纳米金检测血清中的茶碱的方法

专利名称：	一种利用RNA核酸适配体及纳米金检测血清中的茶碱的方法
摘要：	本发明公开了一种利用RNA核酸适配体及纳米金检测血清中的茶碱的方法，包括如下步骤：生物及临床样本的前处理、嵌合探针与目标miRNA杂交、连接捕捉序列于表面改性酶标板上、核酸杂交形成酶标板‑嵌合探针‑miRNA复合物、RNase ONE核糖核酸酶进行检查和化学发光法检测目标miRNA量和茶碱量；本发明依据Direct PCR技术中的前处理方案，对生物细胞或临床肺癌样本进行化学和生物学处理，降解掉蛋白质和DNA成分，释放出其中的总RNA，而无需进行RNA的提取，这种做法不但会简化实验流程，缩短检测时间，而且能节省珍贵的临床肿瘤样本。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	深圳市诺亚基因科技有限公司
发明人：	李富荣;王勇;桑大伟;邵羲晖;卫志坚
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810194965.7
公开号：	CN108414760A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350
代理人：	汤东凤
分类号：	G01N33/574(2006.01)I;G01N33/533(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/574;G01N33/533
申请人地址：	518000 广东省深圳市盐田区海山街道深盐路2028号百汇鹏湾广场1号楼10层
主权项：	1.一种利用RNA核酸适配体及纳米金检测血清中的茶碱的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)生物及临床样本的前处理：将直肠癌细胞用Tris‑HCl缓冲液稀释，加入蛋白酶K与EDTA，在37℃消化2小时，添加SDS与Tween 20表面活性剂后混合30分钟，去除包裹核酸的蛋白质，释放核酸；接着再加入DNA酶I，37℃反应1小时，降解了基因组中的DNA后，溶液中剩余的即为包含有目标miRNA的总RNA；2)嵌合探针与目标miRNA杂交：将处理好的样本溶液中加入等量的不同DNA‑RNA嵌合探针，探针的RNA部分与其对应的目标miRNA完全互补且标记Biotin，探针的DNA部分与将要连接在酶标板上的对应DNA捕捉序列完全互补，完全混合后，将溶液升温至90℃，然后逐渐降至室温，进行退火，使探针的RNA部分与其目标miRNA杂交；3)连接捕捉序列于表面改性酶标板上：将酸酐或酰胺表面改性96/384孔酶标板用PBS‑Tween 20溶液冲洗三次，活化其上的化学基团，设计并合成5’端修饰氨基或巯基的DNA捕捉序列，通过酯化反应或酰胺反应将捕捉序列连接在酶标板上，然后用BSA蛋白溶液封闭酶标板上未参与反应的化学基团，PBS清洗三遍后，酶标板用塑料膜覆盖，存储于4℃环境中，等待进行下一个步骤；4)核酸杂交形成酶标板‑嵌合探针‑miRNA复合物：将步骤2)中已与目标miRNA杂交的嵌合探针加入步骤3)中已连接DNA捕捉序列的酶标板孔中，加入含有Triton X‑100表面活性剂的Tris‑HCl缓冲液，根据碱基互补配对的原则，嵌合探针的DNA部分与连接在酶标板上的捕捉序列产生杂交，形成酶标板‑嵌合探针‑miRNA复合物，通过核酸链之间的杂交作用将嵌合探针与目标miRNA固定在酶标板上；5)RNase ONE核糖核酸酶进行检查：RNase ONE核糖核酸酶通过降解双链RNA中发生错配或部分互补的单链RNA，检查嵌合探针上杂交的miRNA，即使是仅与目标miRNA相差1个核苷酸的同源miRNA也能被其识别并降解；6)化学发光法检测目标miRNA量和茶碱量：加入SA‑HRP，该蛋白与通过了RNase ONE核糖核酸酶检查，跟目标miRNA完全互补的嵌合探针Biotin标记迅速结合，然后添加Luminol、双氧水和化学发光增强剂，利用该蛋白上连接的HRP与Luminol‑H2O2发生酶促反应，产生强烈的425nm荧光，荧光酶标仪检测其荧光强度值，根据不同荧光强度值推算出其所对应的目标miRNA量；同时将茶碱RNA aptamer截断为两部分并与纳米金相结合，克服了RNA容易降解的缺陷，在血清中检测了茶碱的浓度。
所属类别：	发明专利