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一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法
| 专利名称： | 一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法 |
| 摘要： | 本发明公开了一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法。具体步骤如下：(1)制备FPBS重悬的尿液细胞；(2)将APTES加入到培养皿，避光放置、洗涤烘干；(3)将重悬的尿液细胞加入APTES培养皿中培养，再依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；(4)吸除培养皿中的脱脂牛奶(5)向脱脂牛奶中加入anti‑CK抗体和CD45抗体，混合均匀后加入培养皿中，避光孵育；加入DAPI，常温避光孵育；吸除抗体，再加入PBS扫描；(6)吸除脱脂奶粉后，显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色。本发明方法用于无创检测膀胱癌，具有高敏感性和高特异性。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 上海;31 |
| 申请人： | 上海浦美生物医药科技有限公司;南京鼓楼医院 |
| 发明人： | 杨荣;郭宏骞;祝琳;顾媛媛;张群;张士伟;王鑫 |
| 专利状态： | 有效 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201810233583.0 |
| 公开号： | CN108489795A |
| 代理机构： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 |
| 代理人： | 杨军 |
| 分类号： | G01N1/40(2006.01)I;G01N21/64(2006.01)I;C12N5/09(2010.01)I;G;C;G01;C12;G01N;C12N;G01N1;G01N21;C12N5;G01N1/40;G01N21/64;C12N5/09 |
| 申请人地址： | 201203 上海市浦东新区浦东自由贸易试验区碧波路572弄116号2幢A座 |
| 主权项： | 1.一种尿液肿瘤细胞富集和检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)取100mL尿液离心，以1ml含有1wt％FBS的PBS溶液将沉淀重悬，得到FPBS重悬的尿液细胞；(2)将培养皿清洗后，将2wt％APTES溶液加入到培养皿表面，避光放置1～1.5h，再吸除多余的APTES，纯水清洗若干次后，培养皿置于75～85℃的烘箱中烘干；(3)将步骤(1)的FPBS重悬的尿液细胞加入到步骤(2)中的APTES培养皿中培养，之后吸除多余液体，依次用多聚甲醛固定、PBS清洗、以及脱脂牛奶封闭；(4)吸除步骤(3)的培养皿中的脱脂牛奶后，向培养皿中加入PBST清洗；(5)向1ml 5wt％脱脂牛奶中加入2μL的anti‑CK抗体和3μL的CD45抗体，混合均匀后加入到培养皿中，4℃避光孵育过夜；吸除抗体，用PBST清洗，加入1mL的DAPI，常温避光孵育1小时；吸除抗体，用PBST清洗，再加入1mL的PBS扫描；使用GE Cytell细胞成像系统进行扫描；(6)吸除脱脂奶粉后，在显微镜下进行多色成像分析，选择CY5、FITC和DAPI的滤光片，观察通道表面荧光颜色；观察通道表面荧光颜色，显蓝色的则DAPI+，不显蓝色则DAPI‑，显绿色则CK+，不显绿色则CK‑，显红色则CD45+，不显红色则CD45‑，根据荧光显色，当DAPI+/CK+/CD45‑且满足形态学特征的为循环肿瘤细胞，然后对所有的循环肿瘤细胞计数，获得检验结果。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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