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原文传递肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法

专利名称：	肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法
摘要：	本发明属于肿瘤检测技术领域，公开了一种肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞的检测方法，纳米复合探针由金纳米粒子核、发夹DNA H1及摆臂Walker‑Blocker组成；DNA四面体复合物顶点连接发夹DNA H2；miRNA‑21为3D DNA Walker激活剂；Walker DNA、H1、H2的DNA步行器循环信号放大，对miRNA‑21的比率型、荧光拉曼双模式检测；金纳米粒子和DNA四面体结构进入肿瘤细胞内，对肿瘤细胞的比率型、荧光拉曼双模式成像检测。本发明结合3D DNA Walker纳米机器放大及DNA四面体纳米探针对肿瘤细胞标志物miRNA‑21及肿瘤细胞进行比率型、双模式检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	青岛科技大学
发明人：	何鹏;毕成;韩文豪;宋维玲;牛淑妍
专利状态：	有效
申请日期：	2019-08-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-15T00:00:00+0800
申请号：	CN201910807092.7
公开号：	CN110455764A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	汤东凤
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	266042山东省青岛市市北区郑州路53号青岛科技大学化学与分子工程学院
主权项：	1.一种肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法的纳米复合探针由金纳米粒子核、Cy5修饰的发夹DNA H1以及摆臂Walker-Blocker组成；DNA四面体复合物的顶点连接Rox修饰的发夹DNA H2；miRNA-21作为3D DNA Walker的激活剂；3D DNA Walker触发后，Walker DNA、H1、H2的催化发夹反应进行信号放大，实现对miRNA-21的比率型、荧光拉曼双模式检测；金纳米粒子和DNA四面体结构可以进入肿瘤细胞内，实现对肿瘤细胞的比率型、荧光拉曼双模式成像。 2.如权利要求1所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法包括以下步骤：第一步，制备3D DNA Walker纳米复合探针；第二步，制备DNA四面体复合物；第三步，将第一步和第二步的产物与miRNA-21反应，进行体外双模式检测；第四步，将第一步和第二步的产物与肿瘤细胞孵育，进行细胞的双模式成像。 3.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述3D DNA Walker纳米复合探针的合成方法包括：20nm金纳米粒子的合成参考先前的制备方法，于棕色瓶中4℃保存；20μL 10nM的Walker DNA与20μL 10nM Blocker DNA在95℃水浴5min再自然冷却至室温以合成Walker-Blocker；20μL 10nM的发夹DNA H1在90℃的水浴中孵育5min自然冷却至室温，冷却后的H1与20μL 1nM的W-B分别加入TCEP活化；随后加入1mL 20nm的金纳米粒子与20μL醋酸钠缓冲溶液；室温下摇晃过夜，反应完成后离心13000r/min，4℃，15min洗涤三次，分散到80μL 0.1％的PBS缓冲液中。 4.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述DNA四面体复合物的制备方方法包括：DNA四面体的THa-d四条链分散在TM缓冲溶液中至终浓度为50nM，每条链取2μL加入92μL TM缓冲溶液混合均匀；于95℃水浴加热2min，置于4℃1min，合成的DNA四面体的终浓度为1nM；将DNA四面体与退火后的发夹DNA H2等量混合在37℃的水浴中孵育2h。 5.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述miRNA-21的细胞外检测方法包括：10μL分散后的生物条码探针加入10μL不同浓度的miRNA-21在室温下反应2h，再加入10μL1 nM DNA四面体复合物反应2h；反应后的复合物离心a分散到5μL PBS缓冲液中进行细胞外拉曼和荧光检测。 6.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述miRNA的细胞内荧光检测方法包括：癌细胞在胰蛋白酶消化后接种在96孔玻璃底培养板中，当细胞生长至孔板面积的50％时，加入20μL生物条码探针和20μL 1μM发夹DNA H2反应；使用Leica TCS SP5倒置共聚焦显微镜进行荧光成像；所用荧光基团Cy5和Rox的激发光源为633nm和514nm，并且分别使用640-700nm通道和540-640nm通道捕获不同的荧光信号进行成像。 7.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述miRNA的细胞内拉曼检测方法包括：癌细胞在胰蛋白酶消化后接种在金玻璃片上过夜，加入20μL生物条码探针和20μL 1μM发夹DNA H2，进行不同时间的孵育；将细胞培养皿固定到显微镜载物台上，在细胞培养的状态下进行SERS成像；使用拉曼光谱仪的633nm激光器，并用50倍物镜进行SERS细胞成像。 8.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法的拉曼检测数据的处理包括：选取1600cm-1为Cy5的拉曼特征吸收峰，1640cm-1为Rox的拉曼特征吸收峰，分别对其出峰位置的出峰强度进行扣除空白处理，并且使用I1640/I1600为最终的线性分析对象进行线性分析。 9.如权利要求2所述的肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，所述肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法的荧光检测数据的处理：使用648nm的激发波长对Cy5测定荧光光谱，最大发射波长为688nm；使用550nm的激发波长对Rox测定荧光光谱，最大发射波长为610nm，分别对其出峰强度进行扣除空白处理，并且使用F610/F688为最终的线性分析对象进行线性分析。 10.一种应用权利要求1～9任意一项所述肿瘤细胞标志物miRNA-21及肿瘤细胞的检测方法的肿瘤检测系统，其特征在于，所述肿瘤检测系统包括：纳米复合探针由金纳米粒子核、Cy5修饰的发夹DNA H1以及摆臂Walker-Blocker组成；DNA四面体复合物的顶点连接Rox修饰的发夹DNA H2；miRNA-21作为3D DNA Walker的激活剂。
所属类别：	发明专利