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原文传递基于二维液相色谱串联质谱定性鉴定草莓柱头蛋白的方法

专利名称：	基于二维液相色谱串联质谱定性鉴定草莓柱头蛋白的方法
摘要：	本发明公开了一种基于二维液相色谱串联质谱平台定性鉴定草莓柱头蛋白的方法，包括以下步骤：1)、草莓柱头经提取纯化，得蛋白粉；2)、蛋白定量和还原烷基化；3)、蛋白酶解；4)、第一维SCX强阳离子交换液相色谱分离肽段混合物；5)、第二维反向C18液相分离串联Q Exactive质谱分析；6)、数据分析：质谱仪得到的原始文件经Maxquant搜库鉴定，从而获得蛋白和肽段信息列表。采用本发明的方法能对红颊草莓柱头蛋白进行定性鉴定，为构建红颊草莓柱头蛋白信息库提供基础。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州市农业科学研究院
发明人：	裘劼人;王淑珍;柴伟国;阮松林;余红;周厉萍;来文国
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201810955714.6
公开号：	CN108828126A
代理机构：	杭州中成专利事务所有限公司 33212
代理人：	金祺
分类号：	G01N30/88(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/88
申请人地址：	310024 浙江省杭州市西湖区转塘街道洙泗路261号
主权项：	1.基于二维液相色谱串联质谱平台定性鉴定草莓柱头蛋白的方法，其特征是依次包括以下步骤：1)、样品准备和提取纯化；将小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱头按照1:1:1的数量混合后作为样品，经提取纯化，得蛋白粉；2)、蛋白定量和还原烷基化；取裂解液溶解蛋白粉，得蛋白溶液；取含200μg蛋白的蛋白溶液，加入100mM NH4HCO3溶液定容至100μL，再加入11μL 100mM的DTT溶液，混匀后放于37±1℃反应1±0.1h；加入12μL 500mM的IAM溶液，避光室温反应30±2min；3)、蛋白酶解；将步骤2)所得的反应液进行超滤除杂，然后加入100mM NH4HCO3至总体积为100μL，加入4μg Trypsin，于37±1℃反应12～16h，从而实现酶解；上述酶解完成后离心，在离心所得沉淀中加入100mM NH4HCO3 100μL后重复离心一次，合并两次离心所得液，即得肽段溶液；所述离心均为4±1℃12000±2000rpm离心15±2min；肽段溶液中加入5％(V/V)TFA水溶液至TFA终浓度为0.1～1％(V/V)，除盐后冻干，得冻干粉；4)、第一维SCX强阳离子交换液相色谱分离肽段混合物；SCX Buffer A：10mMKH2PO4，25％乙腈，pH 2.9；SCX Buffer B：10mM KH2PO4，400mM KCl，25％乙腈,pH 2.9；步骤3)所得的全部冻干粉用SCX Buffer A复溶，经BioBasic SCX柱梯度分离；分离梯度为：0～5min，0％SCX Buffer B；5～8min,0％～3％SCX Buffer B；8～50min,3％～40％SCX Buffer B；50～60min,40～100％SCX Buffer B；60～65min,100％SCX Buffer B；65‑70min,100～0％SCX buffer B；上述每个时间段的流动相的余量为SCX Buffer A；每个时间段内，SCX Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1ml/min；收集含有肽段的洗脱组分；除盐后冻干，得到肽段粉末；5)、第二维反向C18液相分离串联Q Exactive质谱分析；C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液；C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；步骤4)所得的肽段粉末进行以下的质谱分析：用C18 Buffer A复溶，经AcclaimTMPepMapTM100 C18液相色谱柱梯度在线分离后进Q Exactive质谱仪分析；分离梯度：0～3min,4～7％C18 Buffer B；3～103min,7～18％C18 Buffer B；103～113min,18～35％C18 Buffer B；113～117min,35～75％C18 Buffer B,117～120min,75％C18 Buffer B；上述每个时间段的流动相的余量为C18 Buffer A；每个时间段内，C18 Buffer B的浓度均匀进行改变；洗脱流速为1ml/min；6)、数据分析：质谱仪得到的原始文件经Maxquant搜库鉴定，从而获得蛋白和肽段信息列表。
所属类别：	发明专利