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原文传递盐地碱蓬蛋白质双向电泳系统

专利名称：	盐地碱蓬蛋白质双向电泳系统
摘要：	盐地碱蓬蛋白质双向电泳系统，盐地碱蓬蛋白质提取方法；蛋白定量方法；蛋白质双向电泳方法；第一向等电聚焦；胶条平衡；染色方法；硝酸银染色；考马斯亮蓝染色；胶分析法；蛋白质酶解；硝酸银染色蛋白点的酶解；质谱检测及数据库检索；本发明的盐地碱蓬蛋白质双向电泳系统其有益效果是：通过盐地碱蓬蛋白质双向电泳系统，解决了盐地碱蓬叶片总蛋白的提取，经典的双向电泳结合质谱技术，分辨率高、重复性良好，能实现对大多数蛋白样品的分离与鉴定。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	湖北厚友知识产权服务有限公司
发明人：	不公告发明人
专利状态：	有效
发布日期：	2019-01-01T00:00:00+0800
申请号：	CN201710183523.8
公开号：	CN108627372A
分类号：	G01N1/28(2006.01)I;G01N1/30(2006.01)I;G01N27/447(2006.01)I;G01N33/68(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N1;G01N27;G01N33;G01N1/28;G01N1/30;G01N27/447;G01N33/68
申请人地址：	433199 湖北省潜江市园林南路特8号市知识产权协会
主权项：	1.盐地碱蓬蛋白质双向电泳系统，其特征是：盐地碱蓬蛋白质提取方法：将盐地碱蓬叶片快速用纯水冲洗干净，并在滤纸上吸干；在液氮中将盐地碱蓬叶片研磨成粉末状，分装于1.5mL离心管中；加入样品体积3‑5倍的蛋白提取液，静置过夜（‑20℃条件）；离心（4℃，15000g，1h），弃上清；加入3‑5倍体积的蛋白提取液，‑20℃条件下静置1h；离心（4℃，15000g，1h），弃上清，后重复前步骤；离心（4℃，15000g，1h），弃上清，然后干燥沉淀；上样前离心（4℃，15000g，1h），并用Brandford法定量蛋白；蛋白定量方法：考马斯亮蓝色染液在使用前平衡至室温并混匀；将牛血清蛋白标准溶液（1mg/mL）分别加入到酶标板中，加入PBS补足到15μL；加入285μL考马斯亮蓝染液，混匀，室温防止5min；用酶标仪测定595mm处的吸光值，以不含牛血清蛋白的样品的光吸收值为空白对照；绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度，确定蛋白上样量；蛋白质双向电泳方法：第一向等电聚焦：采用等电聚焦系统，24cm胶条，PH为4‑7；将蛋白样品加入胶条水化液，总体积450μL；缓慢注入胶条槽中，加入胶条后覆盖约1.5μL矿物油；等电聚焦在20℃温度进项，等电聚焦程序如下：30V，12h；200V，1h；500V，1h；5000V，1h；8000V，1h；8000V，10h；第一向等电聚焦允许通过最大电流为50mA/strip；胶条平衡：等电聚焦完毕后，取出胶条，用双纯水冲去胶条表面矿物油，并在滤纸上吸干水分，第一次平衡加入胶条平衡液15ml，在水平摇床上缓慢摇晃15min；平衡完毕后取出胶条，用双纯水冲洗干净后，立即进行第二次平衡，加入胶条平衡液15ml，缓慢摇晃15min，平衡后立即用纯水冲洗干净；第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体方法是将平衡好的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳胶条转移至胶上，保证转移时不产生气泡；加入低熔点琼脂糖封闭板上端；电泳上槽为2电泳液，下槽为1电泳液；电泳条件为：2W/gel，30min；17 W/gel，4.5 min，待溴分蓝条带至凝胶底部时停止电泳；染色方法：硝酸银染色：固定：将凝胶放入染色盒中，加入固定液1L（40%乙醇、10%冰醋酸），固定过夜；水洗：弃去固定液后加入水冲洗三次，每次10min；致敏：加入致敏液（30%乙醇、6.8%乙酸钠、0.2%硫代硫酸钠）1L，致敏30min；水洗：丢弃致敏液，加入水冲洗三次，每次10min；银染：加入染色液（0.25%AgNO3）1L，避光染色20min；水洗：加入水冲洗两次，每次1min；显色：加入显色液（1.46%Na2CO3、0.02%的37%甲醛）1L，先加入少量显色液，待漂去泥沙样背景后，立即更换另一份显色液；终止：加入终止液（1.46%EDTA·Na2·2H2O）1L，终止时间为10min；水洗：用水冲洗一次，染色完毕的胶放入1%冰醋酸保存；染色：将考马斯亮蓝液体倒入胶中，整个染色胶盒在摇床上缓慢摇动至少6h；脱色：将染色完毕的胶用水快速洗涤2次后，加入考马斯亮蓝脱色液，不断更换脱色液直至蛋白点清晰为止；胶分析法：采用Image Scanner Ⅲ凝胶扫描系统获取胶图，用ImageMater 2D Platinum 7.0软件进行胶图分析；分析比较每张胶图上的V%值，出现2倍以上的差异被认为具有统计学意义；蛋白质酶解：采用水冲洗两次切取得蛋白胶点；加入考染脱色液，脱色30min；加入脱水液，脱水时间为30min；除去脱水液，加入10ml酶解工作液，吸胀时间为30min；加入20ml酶解覆盖液，37℃水浴酶解至少16h；将上清转移至另一新离心管中；加入50ml蛋白萃取液与剩下的胶中，37℃水浴30min，5000g离心5min；合并上清，冷冻抽干后待做质谱；硝酸银染色蛋白点的酶解：用100ml水清洗胶点两次；每管加入酶解脱色液50ml，待颜色完全脱去后吸出液体，然后加200ml水停止反应；吸出水，再加200ml水洗胶点两次；加入25mmol/L NH4HCO3 50ml，吸涨5min后吸出液体；加50%乙晴100ml，5min后吸出液体；加100%乙晴100ml脱水，至胶块完全变白即可，吸出液体；每管加3ml煤液，充分吸涨后加20ml覆盖液；37℃恒温水浴锅中酶解16h；溶液转移至新离心管中，胶粒再采用50ml萃取液抽提，合并蛋白萃取液以及前面的溶液，冷冻干燥，待做质谱；质谱检测及数据库检索：将干粉溶解于5ml含0.1%TFA溶液中；按照1:1的比例与含50%CAN和1%TFA的α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸饱和溶液混合；取1ml样品于ABI4800串联飞行时间质谱仪进行质谱点靶鉴定；数据采集采用正离子模式和自动获取数据的模式；PMF的质谱扫描范围：800‑3500Da；选择强度最大的10个峰进行二级质谱；将一级和二级质谱数据整合，并使用GPS 3.6和Mascot 2.1对质谱数据进行分析和蛋白鉴定。
所属类别：	发明专利