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原文传递一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法

专利名称：	一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法
摘要：	本发明公开了一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法。采用90℃条件下在恒温水浴锅中提取多糖，盐酸水解多糖的方式获得多糖水解液，PMP衍生化后，用高效液相色谱进行定性定量检测分析。本发明通过该方法定量分析十种贝母中多糖的组成及含量，具有良好的线性，灵敏度，回收率，重复性和稳定性。不同贝母中均含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，它们具有相同的单糖组成但不同的比例。充分提高贝母的利用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	湖北科技学院
发明人：	范宝磊;李婷婷
专利状态：	有效
申请号：	CN201811343322.0
公开号：	CN109212103A
代理机构：	武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222
代理人：	彭劲松
分类号：	G01N30/02(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	437100 湖北省咸宁市咸宁大道88号
主权项：	1.一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生HPLC方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品处理a、多糖的提取将贝母粉碎，过60筛，准确称取10g与盛有100ml无水乙醇的圆底烧瓶进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时以除去脂质，过滤后取滤渣将此操作重复一次，过滤后在常温下干燥30min；取干燥后的滤渣放置在加有300ml蒸馏水的圆底烧瓶中；热水提取：90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后收集滤液，合并两次的滤液，使用旋转蒸发仪在59℃下将过滤的上清液蒸发至原始体积的1/3‑1/4，将4倍体积的无水乙醇加入多糖浓缩液中，在4℃放置12h，在4℃下离心(15min，8000r/min)、收集得到贝母粗多糖；将粗多糖加入80ml蒸馏水溶解，再加入10ml的Sevag试剂(氯仿：正丁醇(V/V)＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到贝母多糖；b、多糖的水解盐酸水解：将贝母多糖样品10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加2ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在恒温水浴锅90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液多糖水解液，待衍生化；(2)单糖PMP的衍生化a、精密称取单糖样品，分别于10ml容量瓶中，加5ml氨水制成混合单糖溶液，精密取200μl，加入200μl PMP甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调节至中性，混匀后加1ml氯仿用于超声萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r)后收集上清液，最后用0.45um滤膜过滤，稀释到一定浓度后待测；b、精密量取200μl步骤(1)b多糖水解液，加入200μl的氨水溶液，按照上述方法PMP衍生处理后待测；c、分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测；(3)用高效液相色谱质谱联用仪：岛津HPLC‑16二元泵输送系统，紫外检测器SPD‑16，检测波长：250nm，柱温：30℃，流速：1.0ml/min，色谱柱：Inertsil ODS‑3，C18柱(4.6×250mm，5um)，流动相：77％磷酸盐(0.05mol/L，PH＝6.8，)‑23％乙腈，进样量：12、色谱条件：色谱柱型号Shim‑pack VP‑ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵‑乙腈，梯度洗脱程序：0‑5mim17％乙腈；5‑10min18％乙腈；10‑15min19％乙腈；15‑19min21％乙腈；19‑25min18％乙腈25‑40min15％乙腈；进样量：2μl；(4)定性定量检测：取步骤(2)a经PMP衍生处理后6种单糖对照品的混合溶液，于步骤(3)条件下进样测定；将步骤(2)b经PMP衍生处理后的贝母样品于步骤(3)条件下进样测定；取步骤(2)c经PMP衍生处理后的一系列不同质量浓度的6种单糖对照品的混合溶液，于高效液相色谱质谱联用仪设定的条件下分别进样测定，重复6次，测定其对应浓度的色谱峰面积，进行线性回归，得到回归方程，相关系数和线性范围、定量限和检测限见表1；用线性方程对样品进行定量，样品中单糖的响应值应在仪器检测的线性范围内；表1混合单糖标准品的标准曲线、检测限和定量限注：LOQ为定量限，LOD为检出限。
所属类别：	发明专利