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原文传递一种抗体偶联纳米金探针检测CNN2的方法及应用

专利名称：	一种抗体偶联纳米金探针检测CNN2的方法及应用
摘要：	本发明公开一种抗体偶联纳米金探针检测CNN2的方法及应用，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。这是一种采用基于纳米金探针的酶联免疫吸附试验用于抗CNN2抗体高灵敏检测的信号放大策略。此探针由HRP酶标记的羊抗人IgG抗体高负载于纳米金表面形成，且稳定性好，易制备。在检测进程中，首先利用基因工程菌表达纯化可溶性肝细胞癌相关抗原CNN2，并以此蛋白作为抗原，分别检测肝细胞癌、肝炎、肝硬化、肝良性肿瘤及正常人血清中抗CNN2抗体的水平。在肿瘤诊断、肿瘤预后与监测的评估中具有较广阔的应用前景。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广西;45
申请人：	广西医科大学
发明人：	赵永祥;周素芳;张坤;黄勇
专利状态：	有效
申请号：	CN201810689765.9
公开号：	CN109254151A
代理机构：	北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350
代理人：	韦肖燕
分类号：	G01N33/68(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	530001 广西壮族自治区南宁市青秀区双拥路22号
主权项：	1.一种抗体偶联纳米金探针检测CNN2的方法，其特征在于：所述探针的制备方法包括以下步骤：1）纳米金的合成：在 500 mL 三口烧瓶中加入 250 mL水，再加入 2.5 mL 1% HAuCl4，在电炉上加热至沸腾后，快速加入 4.4 mL 1%柠檬酸钠，溶液在 2～3 min 内其颜色由淡黄色—蓝色—酒红色逐渐变化，然后继续保持沸腾 10～15 min，移走热源，在室温下继续搅拌至冷却，最后定容到 200 mL，置 4 ℃冰箱冷藏备用，用该法制得的纳米金颗粒的直径为 13 nm 左右；2）探针的合成（1）用0.1M的K2CO3溶液将10 mL的新合成的AuNPs的pH调至9.0；（2）取HRP酶标记的羊抗人IgG30μL并用适量的超纯水稀释后，在不断搅拌下逐滴加入到纳米金溶液中，并于室温下静置1h；（3）1 h后，在搅拌下逐滴加入BSA水溶液，使反应体系中BSA的最终浓度达到1%，然后在高速离心机中13500 rpm 离心20 min, 弃上清；（4）用含1%BSA和0.05%NaN3的PB：pH 7.4洗涤，再以13500 rpm离心20 min，弃上清，如此反复洗涤两次；（5）将洗涤后的离心沉淀物用5 mL含5%BSA和0.05%NaN3的PB：pH 7.4重悬，重悬后，经1000 rpm 离心5 min，弃下层沉淀物，置4℃冰箱保存；3） IgG30检测步骤（1）包被：用包被缓冲液pH 9.6将冻干的IgG30抗体溶解稀释至2.5μg/mL，酶标板每孔加100μL 4 ℃过夜，至次日用洗涤液200μL至微量震荡器洗3次，每次3min；（2）封闭：在酶标板的每孔加入250μL新鲜配好的封闭液1% BSA，并置于恒温培养箱中37℃孵育2h；2h后用洗涤液200μL至微量震荡器洗涤；（3）加样：加入待测样品—稀释血清100μL于上述已包被的孔中，并置于恒温培养箱中37℃孵育1h，1h后用洗涤液200μL至微量震荡器洗涤；（4）加检测探针：预先备好稀释的检测探针，然后将新鲜稀释的检测探针100μL加入反应孔中，恒温培养箱中37 ℃孵育45min，然后用洗涤液200μL至微量震荡器洗涤；（5）显色：在上述各反应孔中加入100μL TMB底物显色试剂，恒温培养箱中37 ℃闭光孵育20 min；（6）终止反应：于上述各反应孔中加入100μL终止液；（7）结果判定：于酶标仪检测450 nm处吸光度值。
所属类别：	发明专利