详情

原文传递提取外泌体以及与之结合的生物大分子的方法以及试剂盒

专利名称：	提取外泌体以及与之结合的生物大分子的方法以及试剂盒
摘要：	本发明涉及从一种或多种生物样本中提取外泌体以及与外泌体相结合的生物大分子的方法及其试剂盒。其中，所述与外泌体相结合的生物大分子包括核酸、蛋白质、脂质、和代谢物等，所述生物样本包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、脑髓液、乳液、泪液、以及条件培养基等。提取物可用于协助疾病的检测、预防、并理解疾病的生物学原理。本发明具有多项优势，提供的技术方案简单，成本低，实验耗时短，并能够满足工业上的大规模需求。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	印度;IN
申请人：	阿曼·沙马
发明人：	阿曼·沙马
专利状态：	有效
申请日期：	2017-11-23T00:00:00+0800
发布日期：	2019-07-30T00:00:00+0800
申请号：	CN201780071811.2
公开号：	CN110073195A
代理机构：	深圳市威世博知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	何青瓦
分类号：	G01N1/34(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	印度拉贾斯坦邦斯里甘加纳加尔市斯里加兰布尔区
主权项：	1.一种从一生物样本中提取细胞衍生囊泡体的方法，其中，所述方法包括：第一步，向所述生物样本中加入大分子稳定剂，得到一种混合物，并混合所述混合物；或者在第一步中，向所述生物样本中加入一种稀释液，得到另一种混合物，并混合所述另一种混合物，然后向所述另一种合物中加入大分子稳定剂，并将含有所述生物样本、所述稀释液、以及所述大分子稳定剂的混合物混合均匀；第二步，向第一步得到的混合物中加入体积排斥聚合物，得到一种混合体；第三步，将第二步所得的混合体放入一部台式离心机中进行离心，离心的预设时间为10-20分钟，得到一种离心沉淀和一种离心上清液；第四步，弃去所述离心上清液，然后用一预设浓度的缓冲溶液清洗所述离心沉淀；以及第五步，利用另一预设浓度的缓冲溶液重悬离心沉淀，得到提取出的存在于离心沉淀组分中的细胞衍生囊泡体，其特征在于，所述存在于沉淀组分中的细胞衍生囊泡体的产量范围为2.2xl012-4.5xl014，大小为30-120nm。 2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。 3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本为生物体液，包括但不限于血清、血浆、全血、尿液、唾液、精液、乳液、关节滑液、脑髓液、汗液、泪液、阴道液或羊水。 4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样本包括但不限于用于培养以下任意一种细胞系的细胞培养基：HEK293T细胞系、LN229细胞系、MCF7A细胞系、SiHa细胞系、HeLa细胞系、C33a细胞系、Caski细胞系、A549细胞系、A431细胞系、或Jurket细胞系。 5.根据权利要求1所述的方法，其中，为了使提取得到的外泌体的量可被计量，需要的所述生物样本体积最小为50微升。 6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述稀释液最优为1％(w/w)浓度的磷酸盐缓冲液，并且以反应混合物体积40％(v/v)的比例添加使用。 7.根据权利要求1所述的方法，其中，不包括任何孵育步骤。 8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述体积排斥聚合物以10％-25％(w/v)的量添加使用。 9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述体积排斥聚合物为以下任意一种：葡聚糖、硫酸葡聚糖、乙酸葡聚糖、聚乙二醇、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、或聚醋酸乙烯酯。 10.根据权利要求8所述的方法，其中所述体积排斥聚合物最优是分子量范围为1000-5000Da，pH值为7.2-7.6之间的聚乙二醇。 11.根据权利要求1所述的方法，其中大分子稳定剂包括分子通式为C6H12O7，摩尔浓度为20％-50％的有机化合物钠盐，所述大分子稳定剂以0.2％-5％(w/v)的量加入到生物样本中。 12.根据权利要求1所述的方法，其中大分子稳定剂是分子通式为C6H12O6或C6H22O11其中一种的碳水化合物，所述碳水化合物的摩尔浓度为20％-50％，并以0.2％-5％的量加入到生物样本中。 13.根据权利要求1所述的方法，所述离心速度为1000-5000转/分钟，离心温度不超过4摄氏度。 14.根据权利要求1所述的方法，其中第五步中，用于重悬所述离心沉淀的所述缓冲液为1％(w/w)磷酸盐缓冲液。 15.根据权利要求1所述的方法，其中在第五步完成时，从一生物样本中，提取得到的所述细胞衍生囊泡体含有多种外泌体标记蛋白，包括但不限于抗原CD63(CD63)、抗原CD9(CD9)、抗原CD81(CD81)、HSP70、脂阀结构蛋白-1、脂阀结构蛋白-2、以及Alix蛋白。 16.根据权利要求1所述的方法，其中所述提取得到的细胞衍生囊泡体中不含有可靠计量的细胞裂解物标记蛋白钙联接蛋白。 17.根据权利要求1所述的方法，其中从所述提取的细胞衍生囊泡体中提取得到的蛋白质的量为75微克-500微克每毫升所述生物样本。 18.根据权利要求1所述的方法，其中外泌体的量化体现为估计的总外泌体蛋白质的微克每毫升数。 19.根据权利要求1所述的方法，其中通过估算外泌体膜结合蛋白的量，确定所述外泌体的纯度，所述外泌体膜结合蛋白为乙酰胆碱酯酶，其中所述外泌体的提取灵敏度为每毫升生物体液中含有0.1-1500毫单位的乙酰胆碱酯酶。 20.根据权利要求1所述的方法，其中从所述提取的细胞衍生囊泡体中提取得到的RNA的量为250纳克-450纳克每毫升所述生物样本，从所述提取的细胞衍生囊泡体中提取得到的DNA的量为100纳克-250纳克每毫升所述生物样本。 21.一种制备无细胞衍生囊泡体的血清的方法，其中，所述血清至少去除了部分细胞衍生囊泡体，所述方法包括：第一步，向一种生物样本中加入一种体积排斥聚合物，得到一种混合物；第二步，将第一步中所述混合物放入一台式离心机中离心，预设离心时间为10-20分钟，得到一种离心沉淀和一种离心上清液；第三部，即最后一步，将所述离心上清液转入适合的容器中，即为所述无细胞衍生囊泡体的血清。 22.根据权利要求21所述的方法，其中所述血清包括但不限于以下血清中的一种或多种：牛血清、马血清、人血清、大鼠血清、小鼠血清、兔血清、绵羊血清、山羊血清、羔羊血清、鸡血清、以及猪血清。 23.根据权利要求21所述的方法，其中所述体积排斥聚合物是分子量范围为1000-5000Da，pH值为7.2-7.6之间的聚乙二醇，并以10％-25％(w/v)的量加入到所述生物样本中。 24.一种用于从生物样本中提取分泌的细胞衍生囊泡体的试剂盒，其特征在于，所述细胞衍生囊泡体含有外泌体，其中提取得到的所述外泌体的量为2.2xl012 to 4.5xl014，所述试剂盒包括：一种A溶液，其中含有一种大分子稳定剂；一种B溶液，其中含有一种体积排斥聚合物；以及一种C溶液，其中含有一种释液，所述稀释液含有一种缓冲液。 25.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述体积排斥聚合物是分子量范围为1000-5000Da，pH值为7.2-7.6的聚乙二醇，并以10％-25％(w/v)的量添加使用。 26.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述大分子稳定剂是一种分子通式为C6H12O7，摩尔浓度为20％-50％的有机化合物钠盐，并以0.2％-5％(w/v)的量添加使用。 27.根据权利要求26所述的试剂盒，所述稀释液是浓度为1％(w/w)的磷酸盐缓冲液，并以反应混合物体积40％(v/v)的比例使用，所述生物样本为血清或血浆。
所属类别：	发明专利