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原文传递一种检测植物赤霉素的免疫荧光方法

专利名称：	一种检测植物赤霉素的免疫荧光方法
摘要：	本发明公开了一种检测植物赤霉素的免疫荧光方法，属于植物生物技术领域。一种检测植物赤霉素的免疫荧光方法，包括下列步骤：S1.脱蜡复水；S2.抗原修复；S3.自发荧光淬灭；S4.血清封闭；S5.加一抗体；S6.加二抗体；S7.DAPI复染细胞核；S8.封片；S9.显微镜观察。这种方法简单、快速、安全无毒，有效降低检测成本，用DAPI复染细胞核对组织细胞进行定位，可更好的观察和确定抗原分布的位置；染色后可直接通过荧光显微镜观察赤霉素在植物组织内的分布情况；实验过程最大程度保持植物组织和细胞的原有形态；标记后能保持生物学活性和免疫活性。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	南京烁朴生物科技有限公司
发明人：	白文霞;黄双;徐明智;严鹏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910368869.4
公开号：	CN110082520A
代理机构：	北京挺立专利事务所(普通合伙)
代理人：	盛君梅
分类号：	G01N33/53(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	210000 江苏省南京市麒麟高新技术产业开发区智汇路300号E座301室
主权项：	1.一种检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，包括下列步骤： S1. 脱蜡复水：将植物组织制成石蜡切片后，依次放入二甲苯 I 10min，二甲苯II10min，二甲苯III 10min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，最后用蒸馏水水洗，得脱蜡复水后的组织切片； S2. 抗原修复：将所述脱蜡复水后的组织切片置于抗原修复缓冲液中，放入微波炉内中高火加热8～10min，中火加热3～5min后取出自然冷却至室温，再置于PBS缓冲液中并在脱色摇床上洗涤3次, 得抗原修复后的组织切片； S3. 自发荧光淬灭：将所得抗原修复后的组织切片甩干后，用组化笔在切片上的组织周围画圈，在圈内加入自发荧光淬灭剂使其覆盖全部组织，静置5min后用流水冲洗10min； S4. 血清封闭:在所述圈内滴加BSA血清孵育25～35min，得血清封闭切片； S5. 加一抗体：将所述血清封闭切片上的BSA血清甩去后，在所述圈内滴加一抗体并于4℃孵育过夜，得一抗体孵育切片； S6. 加二抗体：将所述一抗体孵育切片置于室温复温13～15min后，置于PBS缓冲液中并在脱色摇床洗涤3次，每次5min，将洗涤后的一抗体孵育切片甩干后在所述圈内滴加二抗体覆盖组织，避光、室温下孵育1h，得二抗体孵育切片； S7. DAPI复染细胞核：将二抗体孵育切片置于PBS缓冲液中并在脱色摇床洗涤3次，每次5min，随后将洗涤后的二抗体孵育切片甩干后在所述圈内滴加DAPI染液，避光、室温下孵育35～40min，得复染切片； S8. 封片：将复染切片置于PBS缓冲液中并置于脱色摇床洗涤3次，每次5min，随后取出、甩干，然后用抗荧光淬灭封片剂进行封片，得免疫荧光染色切片； S9. 荧光显微镜观察：将所述植物封片放于荧光显微镜下进行观察。 2.如权利要求1所述的检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，所述S1中所述二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III均为浓度为99%的1,3-二甲苯。 3.如权利要求1所述的检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，所述S2中所述抗原修复缓冲液为：pH为6.0的1.8mM/L的一水合柠檬酸和0.2mM/L的二水合柠檬酸三钠的混合液。 4.如权利要求1所述的检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，所述S5中所述一抗体为北京博奥森公司生产的Rabbit Anti-Gibberellins antibody（bs-4606R）。 5.如权利要求1所述的检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，所述S6中所述二抗体为武汉赛维尔生物公司生产的Alexa Fluor®488标记的山羊抗兔IgG（H+L）（GB25303）。 6.如权利要求1所述的检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，所述一抗体是经过PBS缓冲液稀释的，稀释比例为1:100。 7.如权利要求1～6中任一项所述的检测植物赤霉素的免疫荧光方法，其特征在于，所述PBS缓冲液为pH为6.8～7.0的0.05mM/L十二水磷酸氢二钠，0.95mM/L二水磷酸二氢钠和0.725mM/L氯化钠的混合液。
所属类别：	发明专利