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原文传递无细胞损失的微量免疫荧光检测方法

专利名称：	无细胞损失的微量免疫荧光检测方法
摘要：	本发明公开了一种无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，包括以下步骤：0.22um Spin‑X Centrifuge Tube灭菌；将细胞转移到灭菌过的0.22um Spin‑X Centrifuge Tube中直接进行后续步骤或者培养后进行后续步骤；后续步骤包括：PBS缓冲液冲洗、4％多聚甲醛固定、甲醇冰上处理、0.3M甘氨酸封闭液处理、4％BSA封闭液处理、荧光一抗室温避光孵育、DAPI染色液染色、过滤膜放于载玻片中封片，于激光扫描共焦显微镜下观察。该方法弥补了免疫荧光技术难以实现精确的筛选特定细胞的短板，为实现混合细胞群中筛选特定细胞提供一种简单精确以及可视化的技术。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	浙江大学
发明人：	朱成钢;张鹏程
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-22T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910324739.0
公开号：	CN110095599A
代理机构：	杭州中成专利事务所有限公司
代理人：	金祺
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
主权项：	1.无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是包括以下步骤： 1)、0.22um Spin-X Centrifuge Tube灭菌； 2)、将细胞0.5ml转移到步骤1)所得的灭菌过的0.22um Spin-X Centrifuge Tube中直接进行后续步骤3)或者培养后进行后续步骤3)； 3)、对步骤2)所得物进行离心，除去离心所得的液体后，再加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1～3次； 4)、向步骤3)所得物中加入4％多聚甲醛(0.5±0.05)ml于室温下固定10～15min，然后离心去除液体(上层液体，即，除去4％多聚甲醛)； 5)、向步骤4)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后离心，除去离心所得的液体；再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液进行冲洗离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次； 6)、向步骤5)所得物中加入(0.5±0.05)ml甲醇于冰上放置1±0.2min，再离心去除液体，然后用(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)冲洗，除去离心所得的液体，再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液冲洗后离心，除去离心所得的液体；重复次数为1～3次； 7)、向步骤6)所得物中加入0.3M甘氨酸封闭液(0.5±0.05)ml，于室温下封闭20±5min，离心，除去离心所得的液体； 8)、向步骤7)所得物中加入4％BSA封闭液(0.5±0.05)ml于室温下封闭2h～4h； 9)、向步骤8)所得物中加入特异性的荧光一抗(0.5±0.05)ml，于室温避光孵育至少2小时； 10)、向步骤9)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；再重复上述加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次； 11)、向步骤10)所得物中加入(0.5±0.05)ml的DAPI染色液，混匀，室温放置3-5分钟； 12)、向步骤11)所得物中加入(0.5±0.05)ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗，离心，除去离心所得的液体；再重复上述加入0.5ml的PBS缓冲液(pH7.4)进行冲洗后的离心，除去离心所得的液体；重复次数为2～4次； 13)、取出步骤12)所得的0.22um Spin-X Centrifuge Tube的过滤膜，放于载玻片中，封片；于激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。 2.根据权利要求1所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：所述步骤9)的荧光一抗为Anti-HLA Class[MEM-147]abcam。 3.根据权利要求2所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：所述步骤2)中：于37℃，5％CO2培养直至细胞贴附在滤膜上。 4.根据权利要求1～3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：所述步骤13)中的封片采用PBS缓冲液(pH7.4)配制的90％甘油。 5.根据权利要求1～3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：步骤3)冲洗时间为(2±0.5)分钟；步骤5)、步骤6)、步骤10)、步骤12)的冲洗时间为(5±1)分钟。 6.根据权利要求1～3任一所述的无细胞损失的微量免疫荧光检测方法，其特征是：所述离心为(1500±300)g离心(60±10)s。
所属类别：	发明专利