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肥大细胞糜蛋白酶体外微量快速检测方法
| 专利名称： | 肥大细胞糜蛋白酶体外微量快速检测方法 |
| 摘要： | 肥大细胞专属酶糜蛋白酶(Mast cell chymase,MC‑chymase)是一种丝氨酸蛋白酶，主要位于皮肤的真皮层以及结缔组织的肥大细胞亚群中(MCTC)。MC‑chymase在炎症、细胞外基质重构和组织微环境的稳态维持起到重要作用。本发明是基于chymase与其专属性底物相互作用后释放自由对硝基苯胺基团(PNA)的原理，建立了一个chymase活性检测的薄层层析系统，薄层层析结果表明chymase的浓度和颜色强度正相关(图A)，可以作为一个体外微量快速检测的便携式新方法(图B)。本发明适用于人、大鼠和肥大细胞细胞的研究，特点是微量，无需血清制备，分析耗时短，易操作。 |
| 专利类型： | 发明专利 |
| 国家地区组织代码： | 江苏;32 |
| 申请人： | 常州大学 |
| 发明人： | 周晓鹰;储奕 |
| 专利状态： | 有效 |
| 发布日期： | 2019-01-01T00:00:00+0800 |
| 申请号： | CN201810038583.5 |
| 公开号： | CN108287210A |
| 分类号： | G01N30/90(2006.01)I;G;G01;G01N;G01N30;G01N30/90 |
| 申请人地址： | 213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号 |
| 主权项： | 1.一种涉及到血液肥大细胞糜蛋白酶(chymase)活性表达的体外快速检测方法，特征在于用于薄层层析法进行检测，步骤如下：A.准备工作：缓冲液的准备：Chymase专属底物N‑succinyl‑Ala‑Ala‑Pro‑Phe p‑nitroanilide(AAPF‑pNA)(2mM)溶于缓冲液(0.3M Tris base,1.5M NaCl，pH 8.0)；样液的准备：chymase原液、人鲜血、正常或CIA大鼠眼眶取新鲜血液2μL，加入2μL含AAPF‑pNA底物的缓冲液，37℃孵育30‑60分钟；展开剂准备：石油醚和丙酮，比例为3:1配制成展开液；薄层层析板的准备：薄层层析硅胶板(GF254)，长6.0cm，宽2.0cm(长度根据本方法优化后的Rf值而确定，宽度可根据样品数量增减),厚度2.0mm。B.点样和层析：硅胶板点样点距底边0.5cm,点样品间距1.0cm。点加2μL上述样品溶液，并将点样后的硅胶板在展开剂中展开；C.观察：展开剂前段接近硅胶板前沿距离顶端1.5cm时取出，风干后置于紫外灯下观察，紫外灯波长为365nm；D.Chymase活性的确认：测量原点至层析斑点距离，原点至溶剂前沿距离，计算Rf值，确认chymase水解AAPF‑pNA释放的对硝基苯胺(PNA)的位置，紫外灯下观察薄层层析板上黄色斑点的大小和颜色强弱，与斑点强度灰度值vs浓度的标准曲线比较，确定血液中chymase活性的大小。 |
| 所属类别： | 发明专利 |
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