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原文传递一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法

专利名称：	一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法
摘要：	本发明公开了一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，使用顺铂溶液对载体细胞进行预处理染色，并将待测细胞和载体细胞混合后染色，送入质谱流式平台检测，使用手动画门或自动聚类方法检测待测细胞，本发明与已建立的基于顺铂的外周血单个核细胞存活率检测方案兼容，避免了渗透性试剂对跨膜蛋白检测的影响，此外，可以使用多个常用细胞系，需要的细胞样品量少，可以实现微量检测。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海交通大学
发明人：	丁显廷;李轶洋;朱大为
专利状态：	有效
申请日期：	2022-09-22T00:00:00+0800
发布日期：	2023-01-03T00:00:00+0800
申请号：	CN202211159838.6
公开号：	CN115561146A
代理机构：	上海旭诚知识产权代理有限公司
代理人：	郑立
分类号：	G01N15/14;G01N27/62;G;G01;G01N;G01N15;G01N27;G01N15/14;G01N27/62
申请人地址：	200240 上海市闵行区东川路800号
主权项：	1.一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、准备载体细胞：准备含顺铂的试剂和载体细胞，使用顺铂对载体细胞染色；步骤2、准备待测细胞；步骤3、细胞检测：将待测细胞与载体细胞混合后染色，并送入质谱流式平台检测。 2.如权利要求1所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述步骤1包括：步骤1.1准备试剂：a.将以下试剂放置室温中平衡温度：不含Ca2+/Mg2+的PBS；2×固定液，固定液为含3.2％PFA的PBS；细胞染色缓冲液，细胞染色缓冲液为含0.5％BSA和0.02％NaN3的PBS溶液；浓度为1mM的溶于DMSO的198Pt-cisplatin溶液，采用铂-198的顺铂；b.将以下试剂水浴预热至37℃：不含FBS的DMEM/1640；胰蛋白酶-EDTA，具体为含0.5g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA·4Na的Hanks平衡盐溶液。 3.如权利要求2所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述步骤1还包括：步骤1.2准备细胞系：针对贴壁细胞，用1-2mL胰蛋白酶-EDTA将贴壁细胞彻底消化至单个、漂起、形状变圆的单个细胞；针对悬浮细胞，用移液枪吹打至单个细胞；而后加入10mL倍数体积的不含FBS的DMEM/1640后用移液器吹打或涡旋振荡后，常温600g离心5min后弃上清；以上不含FBS的DMEM/1640洗涤细胞的步骤重复2次；步骤1.3载体细胞染色：重悬混匀细胞悬液；加入等倍体积的2×固定液，此后立即用移液器吹打或涡旋振荡混匀，室温孵育10min；加入4ml冰冷的不含FBS的DMEM/1640；4℃600g离心5min后去上清；用不含FBS的DMEM/1640重悬细胞，并将细胞密度调至1×107/mL以下，加入198Pt-cisplatin溶液混匀，终浓度为1uM，37℃孵育10min；加入2～5倍体积的常温的细胞染色缓冲液，混匀中止标记反应，常温300g离心5min，去上清；用常温的细胞染色缓冲液重复洗涤细胞的步骤重复2次，最终将细胞密度调至1×107/mL，每份样本需要至少1×106个载体细胞。 4.如权利要求1所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述顺铂选自198Pt顺铂、190Pt-顺铂、192Pt-顺铂、194Pt-顺铂、195Pt-顺铂和196Pt-顺铂中的一种。 5.如权利要求1所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述步骤2包括：混合待测细胞与载体细胞，准备5×104～1×105个待测细胞，将PFA固定、冻存的待测细胞在冰上或者冷水浴中融化后，Vortex重悬细胞，加入2mL细胞染色缓冲液，600g 5min离心去上清，用1mL细胞染色缓冲液重悬待测细胞，待测细胞中加入1～2mL细胞密度为1×107/mL的载体细胞悬液。 6.如权利要求1所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述步骤3包括：将待测细胞与载体细胞混合后，采用常规质谱流式染色方法对细胞进行染色和上机，具体步骤为：加入2mL细胞染色缓冲液，600g 5min离心去上清，加入50uL封闭剂重悬，封闭剂具体为每份人待测样本加入5uLFc受体封闭剂和45uL染色缓冲液，常温放置10min；每个待测样本的试管中加入50uL混合物混匀，每个待测样本的各抗体用量均为1uL，每个待测样本试管混合物总体积为50uL，常温放置30min；加入2mL细胞染色缓冲液，常温500g离心5min，去上清并重复一次；加入100uL PBS重悬细胞，边振荡边逐滴加入1mL细胞核染色液，细胞核染色液具体为在固定破膜液中加入终浓度为125nM的Ir，每个待测样本用量1ml；分别加入2mL细胞染色缓冲液及2mL去离子水，800g离心5min，清洗细胞1次及3次后，加入1ml含有10％EQ beads的水重悬，将样本置于冰上；将细胞悬浮液置于质谱流式细胞仪上样系统中，细胞依次被雾化器雾化成单个分散细胞、被ICP高温离子化成离子云、经过四级杆过滤、进入飞行时间质谱检测器检测，质谱检测器记录下单个细胞的质谱数据，获取经过校正的fcs文件。 7.如权利要求6所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述步骤3还包括：在获取经过校正的fcs文件后，通过手动画门或自动聚类方式将待测细胞与载体细胞的数据进行分离。 8.如权利要求7所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，手动画门的具体步骤如下：首选通过151Eu和153Eu的信号将校正微球的信号去除；然后通过手动圈出89Y-CD45阳性198Pt-阴性信号来分离出待测样本细胞的信号；再利用191Ir-DNA和195Pt的信号圈出单个活细胞；最终圈出高表达CD45的细胞来确认待测样本细胞信号。 9.如权利要求7所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，自动聚类则是按照常规画门方式去除校正微球、多聚体信号、碎片信号后进行自动聚类，聚类参数选择CD45和198Pt。 10.如权利要求1所述的一种利用铂嵌合载体细胞的质谱流式平台微量细胞样品检测方法，其特征在于，所述载体细胞选自HeLa、L929、PC-3和P3X细胞中的一种。