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原文传递一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法

专利名称：	一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法
摘要：	本发明提供了一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，包括以下步骤：(1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液；(2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记；(3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测；(4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫检查点蛋白在不同亚群细胞中的表达水平。本发明在高度异质性的肿瘤相关免疫细胞中准确反映肿瘤免疫治疗临床响应程度的免疫细胞亚群；确定合适的肿瘤免疫检查点蛋白的表达水平阈值，使检测结果获得最佳的临床相关性。有较好的临床应用前景和较大的社会效益。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海宸安生物科技有限公司
发明人：	魏然;王宇翀;孙双午
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-11T00:00:00+0800
发布日期：	2019-11-05T00:00:00+0800
申请号：	CN201910623844.4
公开号：	CN110412286A
代理机构：	上海申浩律师事务所
代理人：	秦华毅
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	201203 上海市浦东新区祖冲之路1505弄138号6层
主权项：	1.一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1)收集肿瘤患者的癌组织活检样本或血液样本进行处理，制备单细胞悬液； (2)利用金属元素标记的抗体对上述重悬的单细胞悬液同时进行多靶点标记； (3)将标记好的单细胞样品通过质谱流式系统进行检测； (4)基于所得到的质谱流式检测数据，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析，定量分析肿瘤免疫检查点蛋白在不同亚群细胞中的表达水平； (5)经过数据处理和降维算法计算后，绘制二维散点图、SPADE图或热图，进行可视化数据展示；构建信息学分析模型，对不同免疫细胞亚群进行聚类分析。 2.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(1)肿瘤活检样本通过消化或解离的方式制备成单细胞悬液，或者血液样本离心、过滤后重悬制成肿瘤单细胞悬液；在所述单细胞悬液中加入红细胞裂解液，离心去除红细胞；于肿瘤单细胞悬液加入其1/10体积的16％甲醛溶液，25℃固定10分钟；用1mL染色缓冲液清洗细胞，重复2遍，并用0.5mL的染色缓冲液重悬肿瘤单细胞；所述染色缓冲液含有0.5％的牛血清蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。 3.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)肿瘤单细胞悬液中加入含有0.5％的牛血清白蛋白及0.02％叠氮化钠的磷酸盐缓冲液配制的、带有金属元素标签标记的、用于免疫细胞分型的抗体和识别肿瘤免疫检查点的抗体的染色缓冲液，所述免疫分型的抗体选自识别CD45、CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD20、CD56、HLA-DR；所述肿瘤免疫检查点的抗体选自识别CD279、PD-L1、CD152、CD223、CD366、CD278、CD134、CD137、CD95、CD80、VISTA、CD272、TIGIT、CD357、CD27、CD28、IDO、CD48或CD154的抗体，室温25℃混合孵育30分钟。 4.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(2)用于作为抗体标签的金属元素选自：钇Y、钌Ru、铑Rh、钯Pd、镉Cd、铟In、镧La、铈Ce、镨Pr、钕Nd、钐Sm、铕Eu、钆Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、镱Yb、镥Lu、铂Pt或铋Bi。 5.根据权利要求1所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述步骤(4)质谱流式系统输出的原始数据信号为金属元素标签的金属原子丰度信号，根据前述相应抗体所带的金属标签信息，转换为细胞中相应靶标蛋白的表达丰度信息；将多维的蛋白丰度信息进行降维算法数据处理，绘制一系列二维散点图；进一步数据进行SPADE分析，得到肿瘤免疫靶点在不同亚群细胞中的表达水平。 6.根据权利要求5所述的一种利用质谱流式系统对肿瘤样本进行单细胞检测的方法，其特征在于，所述SPADE分析，其分析步骤为： (1)密度相关的下采样，先求出每个细胞邻近范围内的细胞数，作为其密度。将密度小的细胞保留，密度大的细胞随机采样，保证细胞越稀疏则留下的概率越大。这样在保留了细胞绝大部分类型的同时，减少了细胞数，降低了后续计算量； (2)凝聚层次聚类，将留下的细胞采用层次聚类的方式，聚成指定数量的类。该步骤将性质相近的细胞聚为一类，方便后续分析； (3)建立最小生成树，计算出聚出的每个类的中心并计算出每个类中心的距离作为相邻类间边的权重，构造出一幅加权无向图。采用Prim算法建立该图的最小生成树。该步骤将细胞的类群构造成为一个树形结构，可以较好地揭示细胞类群之间的联系； (4)上采样，计算每一个细胞分别与各个类群中心的距离，并将该细胞归入与其距离最近的那个类群。这样就将所有细胞都归入了相应的类群； (5)可视化，采用Kamada-Kawai算法，根据得到的最小生成树计算出最小生成树中每个结点的二维坐标。根据每个结点上的细胞数量决定该结点的尺寸大小。对于某个特定的特征，计算出每个结点上该特征的中值。根据数值的高低决定该结点的颜色。这样，对不同的特征，就能生成结点坐标和尺寸一致的对应颜色的图像； (6)根据每个细胞亚群中细胞表面抗原的表达水平，定义每个亚群的细胞类别，对每个细胞亚群的细胞数量进行绝对定量分析，以及不同亚群细胞之间进行相对定量分析。
所属类别：	发明专利