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原文传递基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法

专利名称：	基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法
摘要：	本发明公开一种基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒及检测方法，通过试剂盒及配套的信号通路刺激剂、检测抗体，利用质谱流式检测技术，能够实现特异地、有效地、高通量地以及单细胞水平地检测细胞内信号通路激活水平，大大提高了样品检测的精度，极大程度地避免了传统检测手段可能存在的假阴性分析结果。
专利类型：	发明专利
申请人：	浙江普罗亭健康科技有限公司
发明人：	王平;吕聪;林铖
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T10:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T22:00:00+0805
申请号：	CN202010026099.8
公开号：	CN111189761A
代理机构：	杭州华知专利事务所(普通合伙)
代理人：	杨秀芳
分类号：	G01N15/10;G01N1/30;G;G01;G01N;G01N15;G01N1;G01N15/10;G01N1/30
申请人地址：	310018 浙江省杭州市余杭区文一西路1500号健康谷5号楼14层
主权项：	1.基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，包括LD液、FⅠ液、FⅡ液、B液、W液、P液、D液、BC1-BC10液；所述LD液包括194Pt、RPMI 1640基础培养基，所述FⅠ液包括固定与通透液，所述FⅡ液为甲醛和磷酸盐缓冲液，所述B液为含人免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、仓鼠免疫球蛋白、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液的用于流式细胞技术的封闭缓冲液，所述W液为通透缓冲液，所述P液为固定/通透液，所述D液包括191/193Ir、甲醛和磷酸盐缓冲液，所述BC1-BC10液为包括磷酸盐缓冲液以及Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110中的任两种组合的液体。 2.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，所述LD液为1体积份RPMI 1640基础培养基、0.01体积份1mM194Pt，其中，体积份以mL为计量单位。 3.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，所述F I液为5×固定与通透液。 4.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，所述F II液为0.9-1.3体积份16mg/mL甲醛溶液、9体积份磷酸盐缓冲液，其中，体积份以mL为计量单位。 5.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，所述B液为0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的人免疫球蛋白溶液、0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的小鼠免疫球蛋白溶液、0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的大鼠免疫球蛋白溶液、0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的仓鼠免疫球蛋白溶液、0.5-2质量体积比的牛血清白蛋白、100体积份磷酸盐缓冲液的混合液；其中，质量体积比为以mg为计量单位的牛血清白蛋白的质量与以mL为计量单位的B液体积之比，体积份以mL为计量单位。 6.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，所述W液为1体积份10×通透液、9体积份水，其中，体积份以mL为计量单位。 7.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于所述P液为1体积份固定/通透浓缩液、3体积份固定/通透稀释液，其中，体积份以mL为计量单位。 8.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，D液为0.0005体积份500μM Cell-IDTM Intercalator-Ir(Fluidigm)、0.09-0.13体积份16％甲醛溶液、0.9体积份磷酸盐缓冲液，其中，体积份以mL为计量单位。 9.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，BC1液含1体积份的1.5-2μM Pd104、1体积份的1.5-2μM Pd105、100体积份磷酸盐缓冲液，BC2液含1体积份的1.5-2μM Pd106、1体积份的1.5-2μM Pd108、100体积份磷酸盐缓冲液，BC3液含1体积份的1.5-2μM Pd105、1体积份的1.5-2μM Pd110、100体积份磷酸盐缓冲液，BC4液含1体积份的1.5-2μM Pd104、1体积份的1.5-2μM Pd106、100体积份磷酸盐缓冲液，BC5液含1体积份的1.5-2μM Pd105、1体积份的1.5-2μM Pd108、100体积份磷酸盐缓冲液，BC6液含1体积份的1.5-2μM Pd106、1体积份的1.5-2μM Pd110、100体积份磷酸盐缓冲液，BC7液含1体积份的1.5-2μM Pd104、1体积份的1.5-2μM Pd108、100体积份磷酸盐缓冲液，BC8液含1体积份的1.5-2μM Pd105、1体积份的1.5-2μM Pd106、100体积份磷酸盐缓冲液，BC9液含1体积份的1.5-2μM Pd104、1体积份的1.5-2μM Pd110、100体积份磷酸盐缓冲液，BC10液含1体积份的1.5-2μM Pd108、1体积份的1.5-2μM Pd110、100体积份磷酸盐缓冲液；其中，体积份以mL为计量单位。 10.根据权利要求1所述的基于质谱流式技术的细胞信号通路检测试剂盒，其特征在于，LD液、F I液、F II液、B液、W液、P液、D液、BC1-BC10液保存在2-8℃。 11.基于质谱流式技术的细胞信号通路检测方法，其特征在于，包括以下步骤：一、样品单细胞悬液制备：收集单细胞悬液，以105-108/mL细胞密度加入37℃的无血清RPMI 1640培养基，室温离心300-600g至少1min，弃上清，收集沉淀细胞；二、确定细胞死活：加入1mL由1体积份RPMI 1640基础培养基、0.001-0.1体积份1mM 194Pt配置成的LD液使细胞重悬，37℃孵育至少5min；加入5mL预热37℃的含血清的RPMI 1640培养基，室温离心300-600g至少1min，弃上清；三、刺激剂处理：取1mL含血清的RPMI 1640培养基重悬细胞后，以500μL/孔种在孔板中，37℃细胞培养箱中恢复细胞状态5分钟以上；在500μL含血清的RPMI 1640培养基中加入合适体积的细胞刺激混合剂，混匀后置于37℃细胞培养箱中平衡温度，配制成2×细胞刺激剂；待细胞恢复状态后，将2×细胞刺激剂加入到其中一个含细胞悬液的孔板内，标记为处理组；作为对照，向另一个含细胞悬液的孔板中加入含血清的RPMI 1640培养基，标记为对照组；根据刺激剂处理条件需要，将处理的细胞置于37℃中孵育相应时长；四、细胞固定：向每个含细胞悬液的孔板中加入250μL的5×固定与通透液，混匀后室温孵育不超过60分钟，转移到15mL离心管内，并做好标记；向每个15mL离心管中的细胞悬液中加入7.5mL的质量体积比为0.1-1％、溶于磷酸盐缓冲液中的牛血清白蛋白溶液清洗细胞，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；五、封闭：向每个样品加入50μL的封闭缓冲液重悬细胞沉淀，并转移到干净的1.5mL的EP管中，做好标记，冰上孵育5分钟以上；所述封闭缓冲液为含人免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、仓鼠免疫球蛋白、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液的混合液；六、细胞表面抗体染色：将抗体加入至质量体积比为0.5％、溶于磷酸盐缓冲液的牛血清白蛋白溶液配制呈细胞表面标记物抗体混合液；向每支EP管中加入50μL的细胞表面标记物抗体混合液，混匀后冰上孵育5分钟以上，向每支EP管中加入至少1mL的质量体积比为0.5％、溶于磷酸盐缓冲液的牛血清白蛋白溶液清洗细胞，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；七、通透：向每支EP管中加入1mL的通透缓冲液，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清，重复若干次；每支细胞样品中加入100μL的固定/通透液重悬细胞，室温孵育10分钟以上；向每支EP管中加入1mL的通透缓冲液，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清，重复若干次；八、信号通路抗体染色：加入抗体至质量体积比为0.5％、溶于磷酸盐缓冲液的牛血清白蛋白溶液中配制成信号通路染色液；向每支EP管中加入100μL的信号通路染色液，混匀后冰上孵育10分钟以上，然后加入1mL固定/通透液终止清洗细胞，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清，再加入1mL磷酸盐缓冲液，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；九、细胞二次固定：向每支EP管中加入1mL的甲醛和磷酸盐缓冲液重悬细胞，室温孵育至少5分钟，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；十、DNA染色、固定：向每支EP管中加入1mL的D液，移液枪吹吸混匀重悬细胞后，置于2-8℃冰箱中静置过夜；所述D液包括191/193Ir、甲醛和磷酸盐缓冲液；十一、细胞条形码标记：取出处理组及其对照组细胞样品，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；向每支EP管中加入1mL磷酸盐缓冲液，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；再向向每支EP管中选择一种BC1-BC10液加入100μL，重悬细胞后置于冰上孵育10分钟以上，所述BC1-BC10液为包括磷酸盐缓冲液以及Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110中的任两种组合的液体；向每支EP管中加入1mL质量体积比为0.5％、溶于磷酸盐缓冲液的牛血清白蛋白溶液，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；十二、漂洗、检测：向每支EP管中加入1mL水重悬细胞，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；预备带滤膜滤头的流式管，管壁上做好标记；向每支EP管中加入1mL水重悬细胞后，用移液枪吸取细胞悬液过流式管滤头滤膜转移到相应流式管中，再次加入1mL超纯水清洗EP管壁数次后再次将清洗液用移液枪吸取后过滤同一个流式管滤膜后转移到同一个流式管中，2-8℃离心800-2000g至少1min，弃上清；向每支流式管中加入1mL水重悬细胞后，分别取10μL进行细胞计数；根据细胞计数结果，取等量细胞数的对照组及处理组细胞，混合后，用水再次清洗细胞样品数次后，加入适量的平衡磁珠，在质谱细胞仪上机进行检测，并对两组数据进行处理分析。
所属类别：	发明专利