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原文传递检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用

专利名称：	检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用
摘要：	本发明公开了一种检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用，该传感器由第一试剂和第二试剂组成，所述的第一试剂是覆盖有脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的磁珠水溶液；所述的第二试剂是由覆盖有长链和短链的磁珠形成的DNA Walker体系。通过荧光分光光谱技术分析walker产物，实现了脂多糖的分析检测。本发明方法简单、稳定、特异性强、灵敏度高，可以在10‑4 ng/mL～107 ng/mL范围内线性检测脂多糖，且可以有效地区分脂多糖与其他对照物质。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	上海;31
申请人：	上海大学
发明人：	张娟;岳禧泉;薛添香
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-29T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-02T00:00:00+0800
申请号：	CN201910353584.3
公开号：	CN110082524A
代理机构：	上海上大专利事务所(普通合伙)
代理人：	顾勇华
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	200444 上海市宝山区上大路99号
主权项：	1.一种检测脂多糖用荧光传感器，由第一试剂和第二试剂组成，其特征在于：所述的第一试剂是覆盖有脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的磁珠水溶液，浓度为0.5mg/ml-1mg/ml；所述的脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的的摩尔比为1:1-1:2；所述的第二试剂是由覆盖有长链和短链的磁珠形成的DNA Walker体系，其浓度为0.5mg/ml-1mg/ml，其中长链和短链的摩尔比为1：10-1:20；所述的长链是与第一试剂中的产物进行点击化学识别的链，其碱基序列为：5’-biotin- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-N3-3’；所述的短链为第一试剂互补配对的链，其碱基序列为：5’-biotin-TTTTTTTTTTAGCTGAGGAT-Fam-3’ 。 2.一种制备根据权利要求1所述的检测脂多糖用荧光传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为： a.所述的第一试剂的制备方法为：将脂多糖适配体LPSA链通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠MB上，得到磁珠表面覆盖脂多糖适配体的磁珠MB-LPSA，再加入可以与脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA，得到覆盖双链DNA的磁珠（MB-LPSA/L’）溶液，形成识别体系作为第一反应试剂； b.所述的第二试剂的制备方法为：在pH7.4条件下，按照DNA长链（L）和DNA短链（S）混合摩尔浓度配比为1：10-1:20的混合比例，通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠（MB）形成DNA Walker体系作为第二反应试剂。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其特征在于所述的步骤a的具体步骤为： a-1. 取磁珠浸没在摩尔浓度为4.8 µM的脂多糖适配体链（LPSA）水溶液中，在30℃下反应1小时0.5h-1h； a-2. 将步骤a-1中得到的反应产物冲洗三次去除上清液，然后加入到摩尔浓度为4.8µM的识别链DNA（L’）的水溶液中，于37℃下反应2小时，洗涤去除上清液，加入去离子水，得到MB-LPSA/L’作为第一反应试剂，其浓度为0.5mg/ml-1mg/ml。 4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其特征在于所述的步骤b的具体步骤为： b-1. 将经清洗处理过的磁珠，浸没到含有摩尔浓度为0.12 µM的 DNA长链和摩尔浓度为2.4 µM的 DNA短链的水溶液中，在30摄氏度下反应0.5h-1h； b-2. 将步骤b-1中得到的反应产物经清洗后去除上清液，加入去离子水，配置成浓度为0.5mg/ml-1mg/ml的Walker反应体系作为第二反应试剂。 5.一种脂多糖的检测方法，采用根据权利要求1所述的检测脂多糖用荧光传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为： a.建立标准工作曲线：将每50μL ～100μL第一反应试剂磁分离后去除上清液1，分别浸没在等体积的浓度为0～107ng/mL的靶标物质脂多糖（LPS）的磷酸盐缓冲液中进行识别，得到磁分离后的上清液2，将该上清液2等体积转移到第二反应试剂中进行混合，并加入2～4μL Nicking酶、5～10μLcutsmart和43～86μL缓冲液进行反应0.5小时～1小时，得到产物，利用荧光分光光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并做出靶标物质脂多糖和荧光强度的线性图；所述的磷酸盐缓冲液是 pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液； b.样品检测：将每50μL ～100μL第一反应试剂磁分离后去除上清液1，浸没在等体积的待测的脂多糖样品的磷酸盐缓冲液中，室温下培育0.5小时～1小时，得到磁分离后的上清液2，然后将该上清液2等体积与第二反应试剂混合，并加入2～4μL Nicking酶、5～10μLcutsmart和43～86μL缓冲液进行反应0.5小时～1小时，形成优化的目标检测样品的Walker产物，利用荧光分光光谱分析装置，检测试剂体系的光谱，建立待测脂多糖样品溶液的脂多糖浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，通过分析系统与步骤a所得参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。
所属类别：	发明专利