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原文传递一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒及方法

专利名称：	一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒及方法
摘要：	本发明提供了一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒及方法，该试剂盒包含微球‑GST/6×HIS‑NR LBD蛋白聚合物溶液、SRC‑BAP蛋白溶液、BSA溶液、反应液、清洗液、显色液和显色终止液。本发明通过将活化的微球‑蛋白聚合物溶液、SRC‑BAP蛋白溶液、BSA溶液和待测物质混合孵育，清洗后添加显色液使其显色并终止，利用普通光学酶标仪测定吸光值，通过软件处理吸光值计算得到EC50或IC50，从而能够快速测定化学物质的受体活性。本发明提供的检测方法可以缩短实验周期、增强受体纯度和活性、提高检测灵敏度，从而实现高灵敏、高效快速地进行化学品内分泌干扰受体活性检测筛选的目的。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京大学
发明人：	王小宁;张照斌;贾晓静;王悦;肖寒;李一贤;郭旋;杨磊
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910276982.X
公开号：	CN110095598A
代理机构：	北京君尚知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	余长江
分类号：	G01N33/543(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100871 北京市海淀区颐和园路5号北京大学
主权项：	1.一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，包含微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物溶液、SRC-BAP蛋白溶液、BSA溶液、反应液、清洗液、显色液和显色终止液；其中，所述反应液用于所述微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白溶液和SRC-BAP蛋白溶液的活化和检测体系的配制，其组分包括DTT、Tris-HCl、KCl、EDTA，Glycerol和Tween 20；所述清洗液用于所述微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白溶液、SRC-BAP蛋白溶液和BSA溶液与待测化学物质联合孵育后的清洗，其组分包括Tris-HCl、KCl、MgCl2和Nonidet P-40；所述显色液用于清洗后检测体系的显色，其组分包括Tris-HCl和NPP；所述显色终止液用于检测体系显色反应的终止，其组分为NaOH。 2.如权利要求1所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物溶液是经原核表达系统获得带GST/6×HIS标记的与人或小鼠健康关系密切的核受体配体结合结构域GST/6×HIS-NR LBD蛋白，与预处理的磁性微球联合孵育，使其结合为聚合物，然后用所述反应液洗涤、重悬、低温保存获得。 3.如权利要求2所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述GST/6×HIS标记核受体配体结合结构域GST/6×HIS-NR LBD蛋白是通过以人或小鼠细胞或组织的cDNA为模板，设计扩增与人或小鼠健康关系密切的核受体配体结合结构域NR LBD的引物，通过PCR获得NR LBD片段；利用双酶切将NR LBD片段连接到表达载体上，筛选阳性克隆并测序，提取重组质粒并转化大肠杆菌BL21获得重组表达菌株，进一步将重组表达菌放大培养，IPTG诱导表达，溶菌酶裂解，超声破碎离心所得。 4.如权利要求2所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述与人或小鼠健康关系密切的核受体包括雌激素受体、雌激素相关受体、孕激素受体、雄激素受体、甲状腺激素受体、肝脏X受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、维甲酸受体、维甲酸相关孤核受体、维生素D受体、法尼醇X受体和过氧化物酶体增殖物激活受体。 5.如权利要求1所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述SRC-BAP蛋白溶液是通过以人或小鼠细胞或组织的cDNA为模板，设计扩增核受体转录共激活因子SRC的引物，通过PCR获得SRC片段；同时以大肠杆菌K-12基因组为模板，设计扩增大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的引物，通过PCR获得BAP片段；利用双酶切方法，将SRC片段和BAP片段共同连接到表达载体上，筛选阳性克隆并测序，提取重组质粒转化大肠杆菌获得重组表达菌株，进一步将重组表达菌放大培养，IPTG诱导表达，溶菌酶裂解，超声破碎离心，最后经亲和层析纯化，用所述反应液溶解、低温保存所得。 6.如权利要求1所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述反应液组分包括0.3～5mM DTT，10～100mM Tris-HCl，10～100mM KCl，0.2～10mM EDTA，5～10％Glycerol和0.01～1％Tween 20，其pH为7.2～7.6；所述清洗液组分包括20～100mM Tris-HCl，10～100mM KCl，3～10mM MgCl2和0.1～1％Nonidet P-40，其pH为7.2～7.6；所述显色液组分包括0.2～2M Tris-HCl和5～50mg NPP，其pH为7.5～8.5；所述显色终止液组分为0.5～2M NaOH。 7.如权利要求1所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用微孔板及配套封板膜实现快速测定；所述微孔板包括96孔板、384孔板和可拆卸的排管。 8.如权利要求1所述一种基于磁性微球快速检测化学物质内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述待测化学物质包括天然激素、双酚类、烷基酚类、尼泊金酯类和有机磷酸酯类化合物，所述待测物质的检出范围为10-11～10-1M。 9.一种使用如权利要求1所述的试剂盒快速检测化学物质内分泌干扰活性的方法，包括以下步骤： (1)微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物溶液的活化：取适量所述微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物溶液用预冷的反应液清洗活化，磁性分离，弃去上清液，重复洗涤一次，重悬获得活化的微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物溶液； (2)检测体系的配制和孵育：联合添加步骤(1)中活化的微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物溶液、SRC-BAP蛋白溶液、BSA溶液和适量体积的待测物质到预冷的微孔板孔中，用封板膜封住微孔板各孔，混匀低温孵育； (3)检测体系的清洗：孵育结束后用所述清洗液洗涤步骤(2)所述检测体系，磁性分离，弃去上清液，重复洗涤一次； (4)检测体系的显色和吸光值的测定：添加适量预冷的显色液到微孔板各孔中，用封板膜封住各孔，孵育至显色；显色孵育结束后加入适量显色终止液结束显色；磁性分离，移去微球-蛋白聚合物，测定405nm处各孔的吸光值；计算各待测物质的EC50或IC50值。 10.如权利要求9所述检测方法，其特征在于，步骤(1)所述预冷温度为0～8℃；步骤(2)所述微球-GST/6×HIS-NR LBD蛋白聚合物在检测体系中的浓度范围为0.01～0.05μg/μL；所述SRC-BAP蛋白在检测体系中的浓度范围为0.01～0.05μg/μL；BSA在检测体系中的浓度范围为10-11～10-2M；所述预冷及低温温度为0～10℃；所述反应孵育温度为0～10℃；所述反应孵育时间为20～120min；步骤(4)所述预冷温度为0～10℃；所述显色孵育温度为25～40℃；所述显色孵育时间为10～30min；所述吸光值的测定选用普通光学酶标仪。
所属类别：	发明专利