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原文传递一种快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒及方法

专利名称：	一种快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒及方法
摘要：	本发明公开了一种快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，包含重组人核受体配体结合域hNR‑LBD蛋白溶液、重组人核受体共激活因子‑EcoR I融合蛋白溶液、特异性Taqman探针、A‑DTT缓冲液和B缓冲液。本发明同时还公开了一种快速检测化学品内分泌干扰活性的方法，该方法通过应用所述试剂盒在微孔板上实现对化学品内分泌干扰活性的快速检测。本发明通过Taqman荧光探针法，实现了高通量、多靶标、快速检测包括烷基苯酚类、对烷氧基酚类、尼泊金酯类、双酚类、联苯类、联苯醚类、有机磷类、卤素类化合物等化学品的内分泌干扰活性，检测上限达到10‑11M。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	北京大学
发明人：	张照斌;贾晓静;王悦;杨磊;肖寒
专利状态：	有效
申请日期：	2019-01-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
申请号：	CN201910039763.X
公开号：	CN109827934A
代理机构：	北京君尚知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	董琍雯
分类号：	G01N21/64(2006.01);G;G01;G01N;G01N21
申请人地址：	100871 北京市海淀区颐和园路5号北京大学
主权项：	1.一种快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，包含重组人核受体配体结合域hNR-LBD蛋白溶液、重组人核受体共激活因子-EcoR I融合蛋白溶液、特异性荧光标记的Taqman探针、A-DTT缓冲液和B缓冲液。 2.如权利要求1所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述重组人核受体配体结合域hNR-LBD蛋白是通过以与人内分泌干扰相关的癌细胞株的cDNA为模板，对与人类健康关系密切的核受体配体结合域的编码序列进行扩增，进一步经原核细胞表达与纯化所得。 3.如权利要求1所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述重组人核受体共激活因子-EcoR I融合蛋白是通过以与人内分泌干扰相关的癌细胞的cDNA为模板，对人核受体共激活因子进行扩增，进一步经原核细胞与大肠杆菌Escherichia coli限制性内切酶EcoR I共表达与纯化所得。 4.如权利要求2或者3所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述与人内分泌干扰相关的癌细胞为人源肿瘤细胞，包括人结直肠腺癌细胞Caco-2、人乳腺癌细胞MCF7、人宫颈癌细胞HeLa、人肝癌细胞Hep G2。 5.如权利要求2所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述与人类健康关系密切的核受体包括人雌激素受体、雌激素相关受体、雄激素受体、糖皮质激素受体、维甲酸受体、维甲酸相关孤核受体、过氧化物酶体增殖物激活受体、维生素D受体、肝脏X受体、甲状腺激素受体。 6.如权利要求3所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述人核受体共激活因子包括甾醇受体共激活因子、激活的信号共整合因子2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1。 7.如权利要求1所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，所述特异性荧光标记的Taqman探针的核苷酸序列为5'R-acagtG AATTCtacgCCCCAAaaCgtaGAATTCactga-Q 3'，其中，R为报告基团，包括FAM、TET、JOE、HEX、VIC；Q为淬灭基团，包括TAMRA、DABCYL、BHQ；所述特异性荧光标记的Taqman探针的核苷酸序列中包含EcoR I酶切位点。 8.如权利要求1所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的试剂盒，其特征在于，应用所述试剂盒对化学品内分泌干扰活性进行检测时，可以使用微孔板以实现高通量测定；所述A-DTT缓冲液用于所述重组人核受体共激活因子-EcoR I融合蛋白加入前清洗微孔板孔；所述B缓冲液用于所述特异性Taqman探针加入前清洗微孔板孔。 9.一种使用权利要求1所述试剂盒快速检测化学品内分泌干扰活性的方法，包含： (1)hNR-LBD蛋白吸附：将预冷后的微孔板的各孔分别加入权利要求1所述试剂盒中预冷后的hNR-LBD溶液，用封板膜封住各孔，低温静置过夜，去除封板膜，倒掉孔内液体，用所述试剂盒中预冷后的A-DTT缓冲液清洗各孔； (2)重组人核受体共激活因子-EcoR I融合蛋白和测试样品的添加：倒掉孔内A-DTT缓冲液，每孔分别加入所述试剂盒中预冷的重组人核受体共激活因子-EcoR I融合蛋白溶液和经DMSO梯度稀释的待测物质样品，低温静置，倒掉孔内液体，用所述试剂盒中预冷后的B缓冲液清洗各孔； (3)特异性Taqman探针的添加和荧光信号的测定：分别向微孔板的各孔中加入所述试剂盒中特异性Taqman探针，于37℃放置5min，用荧光分光光度计检测荧光强度。 10.如权利要求9所述的快速检测化学品内分泌干扰活性的方法，其特征在于，步骤(2)中所述待测物质包括烷基苯酚类、对烷氧基酚类、尼泊金酯类、双酚类、联苯类、联苯醚类、有机磷类、卤素类化合物，所述待测物质的浓度为10-4M-10-11M。
所属类别：	发明专利