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原文传递用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒及其应用

专利名称：	用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒及其应用。本发明建立了一种基于VP0重组蛋白检测1型和3型DHAV血清抗体的通用型间接ELISA检测方法，该方法是以原核表达的1型DHAV VP0重组蛋白为检测抗原，经Western blotting和间接ELSIA方法证实该VP0重组蛋白即可以与1型DHAV血清抗体发生特异性反应，也能与3型DHAV血清抗体发生特异性反应，因此以1型DHAV VP0重组蛋白为检测抗原进行间接ELISA检测可判断被检鸭血清是否含有1型和3型鸭甲型肝炎病毒的抗体及其抗体水平，本发明的提出为有效防治鸭甲型肝炎提供了新的快速检测手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	黑龙江;23
申请人：	东北农业大学
发明人：	马波;王君伟;戚海惠;刘悦;张琪;陈浩田;常蕊;张雪莲;张文龙;高明春
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-16T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910304998.7
公开号：	CN110095607A
代理机构：	北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
代理人：	孙皓晨;马鑫
分类号：	G01N33/576(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	150030 黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号
主权项：	1.1型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus1,DHAV-1)VP0重组蛋白在制备检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体通用型检测试剂中的用途。 2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的1型鸭甲型肝炎病毒VP0重组蛋白由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码。 3.用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus,DHAV)血清抗体的通用型间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括1型DHAV VP0重组蛋白包被的ELISA板。 4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的1型DHAV VP0重组蛋白按照以下方法制备得到： 1)以携带1型DHAV VP0基因的阳性质粒作为模板，通过RT-PCR方法对其VP0基因进行扩增、克隆至pMD18-T得到重组质粒pMD18T-DHAV-1-VP0，扩增1型DHAV VP0基因的上下游引物分别是： DHAV-1-VP0上游引物：5’-CCGGAATTCATGGATACTCTCACCAAAAA-3’ DHAV-1-VP0下游引物：5’-CCGCTCGAGTAACTGATTGTCAAATGGTCG-3 2)以EcoR I和Xho I限制性内切酶同时对重组质粒pMD18T-DHAV-1-VP0和pET-30a(+)载体进行酶切，回收目的片段，16℃金属浴连接过夜，将连接产物转化到TG1感受态细胞，提取质粒，质粒经EcoR I和Xho I双酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒pET30a-DHAV-1-VP0； 3)将阳性重组表达质粒pET30a-DHAV-1-VP0转化到RosettaTM(DE3)PlysS感受态细胞，获得的阳性质粒菌于37℃培养，待A600值达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.6mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，超声波破碎，离心后取沉淀进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定，而后沉淀用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱纯化，透析，得到1型DHAV VP0重组蛋白。 5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)中扩增得到的1型DHAV VP0基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的1型DHAV VP0重组蛋白包被的ELISA板是按照以下方法制备得到：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作为抗原包被缓冲液，将DHAV-1-VP0重组蛋白稀释为0.25ug/mL，按100uL/孔加入ELISA反应板中，37℃作用2h，4℃包被过夜，洗涤液洗板，拍干，用5％w/v脱脂乳37℃封闭2小时，以含0.05％v/v吐温-20pH7.4的PBS洗涤，拍干。 7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括样品稀释液、10×浓缩洗涤液、酶结合物工作液、显色液A、显色液B、终止液、阳性血清和阴性血清。 8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含0.05％v/v吐温-20的0.05M pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述10×浓缩洗涤液为含0.05％v/v吐温-20的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述酶结合物工作液为HRP-山羊抗鸭IgG；所述显色液A为0.2mg/mL的四甲基联苯胺溶液，所述显色液B为含0.5‰w/v过氧化氢尿素的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；所述终止液为0.01M硫酸溶液；所述阳性血清为经鸭甲型肝炎病毒1型疫苗和3型病毒尿囊液免疫成年鸭获得的阳性血清；所述阴性血清为未免疫鸭的血清。 9.如权利要求3-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体时，按照以下步骤进行： 1)用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液作为抗原包被缓冲液，将DHAV-1-VP0重组蛋白稀释为0.25ug/mL，100uL/孔，37℃作用2h，4℃包被过夜，洗涤液洗板，拍干； 2)5％w/v脱脂乳封闭，300uL/孔，37℃作用90min，洗涤液洗板，拍干； 3)将待检血清用样品稀释液作1:100稀释，按100uL/孔加入抗原包被板孔中，37℃作用60min，同时设阴性对照，洗涤液洗板，拍干； 4)加入HRP标记的山羊抗鸭IgG与抗原抗体复合物结合，用洗涤液洗板，拍干； 5)加入TMB底物显色液A、B按体积比1:1比例混合后显色，再加入终止液； 6)在波长450nm处读取其吸收值。 10.权利要求3-9任一项所述的试剂盒在制备检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体试剂中的用途。
所属类别：	发明专利