详情

原文传递一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法

专利名称：	一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法
摘要：	本发明公开了一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法及其所筛选的PD‑1单克隆抗体。本发明的单克隆抗体筛选方法，能够同时筛选上百种抗体，并同时比较抗体与抗原的亲和力，选出亲和力最大的抗体株，该方法解决了传统的ELISA检测方法存在的技术缺陷，使其满足快速高通量筛选高亲和力抗体的要求，并能减少抗体毒副作用、延长半衰期、降低免疫源性，对单克隆抗体作为药物进入临床治疗研究具有重要的现实意义。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	河北;13
申请人：	河北仁博科技有限公司
发明人：	姜薇;商涛;李雪健;赵帆
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-12T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910294696.6
公开号：	CN110095612A
代理机构：	北京慧尚知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：	吉海莲;肖辅珍
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	065500 河北省廊坊市固安县新兴产业示范园
主权项：	1.一种基于SPR快速筛选单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)清洗镀金芯片表面； 2)清洗后的芯片用PEG2000溶液进行表面修饰，得到修饰后的芯片； 3)修饰后的芯片用pH4.75的0.01-1mg/mL单克隆抗体样本及阴性对照抗体蛋白的10mM醋酸钠缓冲液进行包被，得到包被后的芯片； 4)通过使目标抗原溶液流经所述包被后的芯片，从而目标抗原与所述芯片上的单克隆抗体发生免疫反应，进行SPR检测筛选得到高亲和力的目标单克隆抗体。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述清洗的具体过程为：首先将镀金芯片在80℃的水：30％过氧化氢：25％氨水的比例为5:1:1的混合溶液中保温10min，再自然冷却10min；然后取出芯片，用去离子水和乙醇依次自上而下冲洗芯片三次，再用氮气吹干以除去镀金芯片在镀金膜过程中残留的杂质和溶剂；接着用等离子清洗机清洗，得到清洗后的芯片。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述修饰的具体过程为：将清洗后的芯片置于1％10mM的PEG2000溶液中，常温过夜14h，然后取出芯片用乙醇自上而下淋洗，再用氮气吹干，得到修饰后的芯片。 4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述包被的具体过程为：首先将修饰后的芯片进行抗体固定，即把70μl含50mM NHS和200mM EDC的水溶液，滴加到所述修饰后的芯片上进行表面活化，然后再滴加pH4.75的0.01-1mg/mL单克隆抗体的10mM醋酸钠缓冲液，在阴性对照点滴加pH4.75的0.01-1mg/mL阴性对照抗体蛋白的10mM醋酸钠缓冲液，以此反应来联接配体；最后以pH 8.6的70μl 1M乙醇胺溶液封闭残存的活性位点，得到包被后的芯片。 5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述检测筛选的具体过程为：首先使用PBST溶液去除吸附在芯片上多余的抗体，然后将目标抗原溶解于PBS中并制备为1μg/mL的溶液作为流动相上机检测，流过所述包被后的芯片表面时与标记抗体结合，以25μl/min进行免疫反应约5min后，通入PBST溶液进行洗脱，洗掉非特异性结合的蛋白；同时根据SPR仪检测的响应值绘制吸附平衡曲线，利用Bioevoluation软件计算该SPR芯片上标记的抗体对抗原的解离常数KD，确定亲和力最高的单克隆抗体，从而筛选得到高亲和力的目标单克隆抗体。 6.一种PD-1单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的氨基酸序列包括轻链和重链；其中，所述轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；所述重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。 7.权利要求6所述的PD-1单克隆抗体的编码基因，其特征在于，该编码基因含有编码如SEQ ID NOs:1-3所示的所述单克隆抗体轻链可变区中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列，以及编码如SEQ ID NOs:4-6所示的所述单克隆抗体重链可变区中的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列。 8.含有权利要求7所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。 9.权利要求6所述的PD-1单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。 10.一种抗肿瘤制剂，其特征在于，包含权利要求6所述的PD-1单克隆抗体。
所属类别：	发明专利