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原文传递一种对于犬瘟热病毒及抗体的ELISA检测方法

专利名称：	一种对于犬瘟热病毒及抗体的ELISA检测方法
摘要：	本发明公开了一种对于犬瘟热病毒及抗体的ELISA检测方法，本发明利用犬瘟热病毒N蛋白在制备犬瘟热检测试剂盒，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明仅使用犬瘟热病毒的N蛋白作为抗原建立ELISA检测方法，N蛋白作为犬瘟热病毒保守蛋白具有较好的抗原性，其能够在防止病毒扩散的前提下对于血清样品中的抗犬瘟热病毒抗体进行量化，检测血液来源机体对于犬瘟热病毒的免疫状态或是细胞所分泌犬瘟热病毒的免疫水平，相比较于其他产品更为安全高效，对于犬瘟热病毒的基础研究以及临床检测具有积极意义。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	广东;44
申请人：	华南农业大学
发明人：	郭霄峰;姜贺;翟燕镅
专利状态：	有效
申请日期：	2019-03-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910244740.2
公开号：	CN110108884A
代理机构：	广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：	单香杰
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	510642 广东省广州市天河区五山路483号
主权项：	1.犬瘟热病毒N蛋白在制备犬瘟热检测试剂盒中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。 2.犬瘟热病毒N蛋白的编码基因在制备犬瘟热检测试剂盒中的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。 3.一种犬瘟热病毒N蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1.获得核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的犬瘟热病毒N蛋白的编码基因，并连入表达载体-，得到重组载体； S2.将重组载体转化入受体菌，得到重组菌； S3.挑取阳性的单菌落培养，液体培养基培养至OD600＝0.8～1，加入IPTG使其终浓度为0.5～1.5mmol/L，36～38℃继续培养3.5～7小时，离心取沉淀； S4.pH＝7.3～7.5 PBS重悬沉淀沉淀，超声破碎，离心取沉淀； S5.9～10倍体积预冷的细胞裂解液Ⅱ重悬沉淀，室温放置3～5分钟，离心收取沉淀； S6.15～20倍体积的包涵体溶解缓冲液Ⅰ重悬沉淀，加入咪唑使其终浓度为65～75mmol/L，通过Ni柱； S7.使用65～75mmol/L咪唑的pH＝7.3～7.5 PBS洗涤3～5次，用300～400mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱液即得；其中，细胞裂解液Ⅱ为pH＝7.9～8.1的40～60mmol/L Tris-Cl、8～12mmol/L EDTA、90～110mmol/L NaCl、0.5～1％(V：V)TritonX-100的水溶液；包涵体溶解缓冲液Ⅰ为pH＝8.4～8.6 40～60mmol/L Tris-Cl、8～12mmol/L EDTA、90～110mmol/L NaCl、7～8mol/L尿素、0.1～0.3mol/L PMSF的水溶液。 4.一种犬瘟热ELISA检测试剂盒，其特征在于，以犬瘟热病毒N蛋白作为包被抗原。 5.根据权利要4所述的犬瘟热ELISA检测试剂盒，其特征在于，还含有包被液、PBS、洗液、封闭液、抗体稀释液、酶标二抗稀释液和终止液。 6.根据权利要4所述的犬瘟热ELISA检测试剂盒，其特征在于，包被抗原犬瘟热病毒N蛋白的浓度为不少于4μg/mL。 7.根据权利要6所述的犬瘟热ELISA检测试剂盒，其特征在于，包被抗原的方法为犬瘟热病毒N蛋白的4μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1小时，放入湿盒中置于4℃过夜；甩干包被液，洗涤液振荡洗涤3次，1min/每次；加入封闭液，100μL/孔，37℃湿盒封闭3h，甩干包被液，洗涤液振荡洗涤3次，1min/每次。 8.一种检测犬瘟热的酶标版，其特征在于，包被有犬瘟热病毒N蛋白。 9.权利要求3中所述的重组菌或重组载体任一在制备犬瘟热检测试剂盒中的应用。 10.权利要求8所述的酶标版在制备犬瘟热检测试剂盒中的应用。
所属类别：	发明专利