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原文传递检测红细胞DNA损伤信号的方法及其在淋巴瘤预后中的应用

专利名称：	检测红细胞DNA损伤信号的方法及其在淋巴瘤预后中的应用
摘要：	本发明属于医药生物领域，具体涉及检测红细胞DNA损伤信号的方法，包括以下步骤:S1:准备血样本；S2:清洗处理对照组和实验组；S3：染色处理第二实验组；S4：重悬处理第二对照组；S5：流式方法检测所述第三实验组和第三对照组；S6：分析结果。本发明还提供了上述方法在在淋巴瘤预后中的应用，对比患者自身DNA损伤信号比例的变化，同时建立健康人群和淋巴瘤疾病人群的DNA损伤信号数据库，快速有效地将淋巴瘤疾病患者DNA损伤信号与数据库进行对比，评估淋巴瘤疾病患者预后。通过微量血样和试剂，快速判断淋巴瘤患者中早期受损的红细胞中的DNA损伤信号的方式，具有特异性强以及灵敏度高的优势。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	浙江;33
申请人：	杭州太铭生物科技有限公司
发明人：	葛建萍;李丹丹
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-08T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910380559.4
公开号：	CN110108888A
代理机构：	无锡市汇诚永信专利代理事务所(普通合伙)
代理人：	王闯
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	311215 浙江省杭州市萧山区萧山经济技术开发区启迪路198号D座706室
主权项：	1.检测红细胞DNA损伤信号的方法，其特征在于，包括以下步骤: S1：固定血样本：获取新鲜抽取的或低温保存的抗凝全血样本，按照1-2％体积比将所述抗凝血样本在室温环境下固定于1％-4％的多聚甲醛溶液当中，固定1小时后，形成含有血样本的固定液； S2：清洗处理对照组和实验组：分别取用100-200μL体积的固定液设置为第一对照组和第一实验组，所述第一对照组和所述第一实验组均在室温环境下离心，弃上清液，保留底部细胞沉淀，随后用500μL1×PBS重悬细胞沉淀，室温环境下离心，完成一次清洗，清洗步骤执行2-3次，得到去除多聚甲醛的第二对照组和第二实验组； S3：染色处理第二实验组：取所述第二实验组加入Human FcR Binding，在4摄氏度下孵育15-20分钟，随后使用染色缓冲剂在室温避光环境下染色所述第二实验组，得到第三实验组，所述染色时间为15-30分钟，所述染色缓冲剂包括RNase的染色试剂和核酸染色剂，所述含RNase的染色试剂包括第一标记物标记的CD235a、第二标记物标记的CD47和第三标记物标记的CD71，所述核酸染色剂为Hoechst33342和Thiazole orange溶于1×PBS； S4：重悬处理第二对照组：使用与所述第二实验组等体积的1×PBS重悬所述第二对照组，得到第三对照组； S5：流式方法检测所述第三实验组以及所述第三对照组：将所述第三实验组和所述第三对照组放置于流式细胞仪中检测，得到检测结果； S6：分析所述检测结果，即获得细胞DNA损伤信号。 2.根据权利要求1或2任意一项所述的检测红细胞DNA损伤信号的方法，其特征在于，步骤S1中，所述抗凝全血样本来源于骨髓或者外周血，所述抗凝全血样本的体积为1-3μL，所述低温环境的温度为4℃。 3.根据权利要求1或2任意一项所述的检测红细胞DNA损伤信号的方法，其特征在于，步骤S3中，所述离心的时间为4-6分钟。 4.根据权利要求1或2任意一项所述的检测红细胞DNA损伤信号的方法，其特征在于，步骤S3中，对应1μL的抗凝全血样本，所述第一标记物标记的CD235a为0.1-0.15μg，所述第二标记物标记的CD47为0.03-0.1μg，所述第三标记物标记的CD71为0.1-0.15μg，所述Hoechst33342为0.014-0.08nmol，所述Thiazole orange为0.04-0.2μg；所述第一标记物为APC通道，所述第二标记物为PE通道，第三标记物为PerCP cy5.5通道。 5.根据权利要求1或2任意一项所述的的方法，其特征在于，步骤S5中，所述流式细胞仪的记录时间小于等于120s，记录个数小于等于100000个，样本流速30μL/min。 6.根据权利要求1所述的检测红细胞DNA损伤信号的方法，其特征在于，所述步骤S6还包括如下步骤： S61：根据所述第三对照组确定CD235a的阴性信号范围，从而在第三实验组中选择含有所述CD235a的阳性细胞群体； S62：在步骤S61的基础上选择CD47表达量处于TOP10％细胞群体； S63：在步骤S62的基础上选择CD71表达量处于TOP5％细胞群体； S64：在步骤S63的基础上选择Hoechst33342和Thiazole orange双阳性的细胞群体，记录CD71表达量为TOP5％的细胞群体中Thiazole orange和Hoechst33342呈现双阳的细胞群体数目及百分比，即为红细胞损伤信号。 7.检测红细胞DNA损伤信号在淋巴瘤预后中的应用，基于权利要求1-6任一项所述的检测红细胞DNA损伤信号的方法，其特征在于，对比患者自身DNA损伤信号比例的变化，同时通过建立健康人群和淋巴瘤疾病人群的红细胞DNA损伤信号数据库，将淋巴瘤疾病患者红细胞DNA损伤信号与数据库进行对比，随后评估淋巴瘤疾病患者预后。
所属类别：	发明专利