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原文传递同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒

专利名称：	同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒
摘要：	本发明公开了同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒。其包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和铕标记的各单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，所述荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线上包被有兔抗鼠多克隆抗体，个数为4条，分别包被各毒素蛋白偶联物，抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。可用于样品中黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	中国农业科学院油料作物研究所
发明人：	张奇;李培武;李慧;白艺珍;张文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910363513.1
公开号：	CN110108873A
代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司
代理人：	乔宇
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路2号
主权项：	1.同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条和铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体、铕标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和铕标记的抗米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中：所述荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述的检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线上包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线个数为4条，检测线上分别上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物和玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物，所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。 2.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体为抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，所述抗赭曲霉毒素A单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201329的杂交瘤细胞株1H2分泌产生，抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201328的杂交瘤细胞株2D3分泌产生。 3.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，所述铕标记的单克隆抗体是按照以下方法制备得到：所述铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体将抗黄曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体：30μg-80μg；所述铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体将抗环匹阿尼酸单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗环匹阿尼酸单克隆抗体：40μg-90μg；所述铕标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体将抗赭曲霉毒素A单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗赭曲霉毒素A单克隆抗体：40μg-90μg；所述铕标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体将抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中溶解、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体：30μg-90μg。 4.根据权利要求3所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，所述的活化方法为取铕标记试剂，用pH 8.2 0.2mol/L的硼酸缓冲液中超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清液，用pH 8.20.2mol/L的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15-30min。 5.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述免疫层析时间分辨荧光试纸条中的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm；检测垫长18～30mm，宽3～4mm；样品垫长10～12mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶；所述的黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮混合污染的免疫层析时间分辨荧光试剂盒还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01％-0.30％的吐温-20水溶液。 6.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物CPA-OVA的包被量为100～400ng；每厘米检测线所需的赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物OTA-BSA的包被量为100～400ng；每厘米检测线所需的玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物ZEN-BSA的包被量为100～400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng。 7.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体冻干品的含量为100～300ng，所述样品反应瓶中铕标记的抗抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的含量为100～200ng，所述样品反应瓶中铕标记的抗赭曲霉毒素A单克隆抗体冻干品的含量为100～300ng，所述样品反应瓶中铕标记的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体冻干品的含量为100～300ng。 8.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下： (1)将吸水纸剪裁得吸水垫； (2)检测垫的制备：将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物、赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白偶联物和玉米赤霉烯酮-牛血清白蛋白偶联物用包被缓冲液配制成浓度为0.2-0.5mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15～20mm的位置，用线喷方式将其于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到4条检测线，然后于37-40℃条件下干燥30-60分钟；将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.2～0.5mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟； (3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥4-10小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； (4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1-3mm，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条。 9.权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮含量检测中的应用，其特征在于：应用方法为：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线时间分辨荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的含量。 10.根据权利要求9所述的的应用，其特征在于：应用方法为：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮浓度的关系曲线是采用以下方法得到的： (1)配制得到一系列浓度的黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮标准品溶液； (2)将适量上述各浓度的黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10分钟，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的荧光强度值，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线时间分辨荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)； (3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素、环匹阿尼酸、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮浓度的关系曲线。
所属类别：	发明专利