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原文传递同步检测黄曲霉菌真菌毒素的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用

专利名称：	同步检测黄曲霉菌真菌毒素的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用
摘要：	本发明公开了一种同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒及其应用。它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条，以及含有铕标记的各单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，检测线上分别包被各毒素的蛋白偶联物，所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。可用于样品中黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸含量的同步检测，具有操作简单、快速、灵敏度高的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	中国农业科学院油料作物研究所
发明人：	张奇;李培武;王督;汪雪芳;张文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910363494.2
公开号：	CN110108872A
代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司
代理人：	乔宇
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路2号
主权项：	1.同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：它包括免疫层析时间分辨荧光试纸条，以及含有铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、铕标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体和铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的样品反应瓶，其中所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条包括底板，底板的粘性面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体，所述检测线个数为3条，检测线上分别包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和环匹阿尼酸-卵清蛋白的偶联物，所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。 2.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体为抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生，抗杂色曲霉毒素单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生。 3.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述铕标记的单克隆抗体是按照以下方法制备得到的：将抗黄曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗黄曲霉毒素单克隆抗体：30μg～80μg；将抗杂色曲霉毒素单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗杂色曲霉毒素单克隆抗体：30μg～80μg；将抗环匹阿尼酸单克隆抗体和活化后的铕标记试剂在硼酸缓冲液中混合、振荡反应，然后经离心、复溶、封闭步骤得到目标产物铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体；1mL活化后的铕标记试剂可偶联抗环匹阿尼酸单克隆抗体40μg～90μg。 4.根据权利要求3所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的活化方法为取铕标记试剂用pH 8.2 0.2M的硼酸缓冲液超声分散，然后缓慢加入碳二亚胺溶液，室温振荡活化，离心去上清，用pH 8.2 0.2M的硼酸缓冲液复溶，备用，所述的活化时间为15～30min。 5.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中的吸水垫长16～18mm，宽3～4mm；检测垫长18～30mm，宽3～4mm；样品垫长10～12mm，宽3～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm；所述的样品反应瓶为1-5mL的卡口瓶；所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，还包括样品稀释液和样品稀释液吸管，所述的样品稀释液为体积分数为0.01～0.30％的吐温-20水溶液。 6.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述荧光试纸条中检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物AFB1-BSA的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物ST-BSA的包被量为100～400ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物CPA-OVA的包被量为100～400ng，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng。 7.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述样品反应瓶中铕标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为100～300ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体冻干品的含量为100～300ng；所述样品反应瓶中铕标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体冻干品的含量为100～200ng。 8.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的的免疫层析时间分辨荧光试剂盒，其特征在于：所述的时间分辨荧光试纸条的制备方法如下： (1)将吸水纸剪裁得吸水垫； (2)检测垫的制备：将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和环匹阿尼酸-卵清蛋白的偶联物用包被缓冲液配制成浓度为0.2～0.5mg/mL的包被液，于距硝酸纤维素膜上沿15～20mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上进行分别间隔包被，得到3条检测线，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配成浓度为0.2～0.5mg/mL的包被液，于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得质控线，每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟； (3)样品垫的制备：将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37-40℃条件下干燥10～16h，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； (4)免疫层析时间分辨荧光试纸条的组装：在PVC底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得免疫层析时间分辨荧光试纸条。 9.权利要求1所述的免疫层析时间分辨荧光速测试剂盒在黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸含量检测中的应用：将待测样品经前处理获得待测样品溶液后，加入样品反应瓶中，混匀，插入荧光试纸条，37℃反应10分钟后，用时间分辨荧光测试仪进行检测，获得荧光免疫层析试纸条上检测线(T)荧光强度与质控线(C)荧光强度的比值；基于荧光免疫层析试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值分别与黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸浓度的关系曲线，获得待测样品溶液中黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸的含量，最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸的含量。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)分别与黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸浓度的关系曲线是采用以下方法得到的： (1)配制得到系列梯度浓度的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸标准溶液； (2)将适量上述梯度的黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸标准品溶液分别加入到样品反应瓶中，混匀，插入免疫层析时间分辨荧光试纸条，37℃反应10min，用时间分辨荧光免疫分析仪检测得到各免疫层析时间分辨荧光试纸条上检测线(T)和质控线(C)的荧光强度，由此获得各免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)； (3)经拟合得到免疫层析时间分辨荧光试纸条检测线荧光强度与质控线荧光强度的比值(T/C)与黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸浓度的关系曲线。
所属类别：	发明专利