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原文传递同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用

专利名称：	同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用
摘要：	本发明公开了同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用。其包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被各毒素蛋白偶联物，所述质控线上包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2分泌产生。其可用于黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸的同步检测，操作简单快速、灵敏度高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	中国农业科学院油料作物研究所
发明人：	张奇;李培武;王督;张兆威;张文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910363226.0
公开号：	CN110108871A
代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司
代理人：	乔宇
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路2号
主权项：	1.同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条，其特征在于：包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下横向设置质控线和检测线，所述检测线位于质控线的下方，个数为三条，呈间隔分布，所述三条检测线上分别包被有杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物、环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物和黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线上包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫上横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体、纳米金标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体和纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体；所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生。 2.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条，其特征在于：所述抗黄曲霉毒素单克隆抗体为由保藏编号为CCTCC NO.C201013的杂交瘤细胞株1C11分泌产生的抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体，抗杂色曲霉毒素单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO.C2013187的杂交瘤细胞株ST03分泌产生。 3.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽2～4mm；检测垫长25～30mm，宽2～4mm；金标垫长6～9mm，宽2～4mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述的吸水垫为吸水纸；所述的底板为纸板。 4.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条，其特征在于：所述检测垫上每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，所述靠近质控线的检测线与质控线的间距为5～7mm。 5.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条，其特征在于：所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng。 6.根据权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的用量为100～200ng。 7.权利要求1所述的检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁成16～18mm即得吸水垫； (2)检测垫的制备检测线的包被：将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物、杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物和环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物用包被缓冲液分别配制成0.25～0.5mg/mL的包被液，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，得到三条检测线，所述检测垫上每厘米检测线所需的黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的包被量为100～300ng；每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng；所述每相邻两条检测线之间的间距为2-3mm，靠近质控线的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm；然后于37～40℃条件下干燥30～60分钟；质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.5mg/mL的包被液；于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟； (3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； (4)金标垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式向已干燥的玻璃纤维膜上横向喷涂纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体溶液、纳米金标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体溶液和纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体溶液的混合溶液，其中：每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的纳米金标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的用量为100～200ng，所需的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的用量为200～400ng，然后真空冷冻干燥2～4小时，置干燥器中室温保存；所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO.C201871的杂交瘤细胞株YTT-2分泌产生； (5)试纸条的组装在底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条。 8.根据权利要求7所述的检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条的制备方法，其特征在于：所述检测线包被中所使用的包被缓冲液为:1g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述质控线的包被中所使用的包被缓冲液为:1g卵清蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述的封闭液是按照下述方法配置得到的：将1～2g卵清蛋白，2～5g蔗糖，0.02～0.05g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述纳米金标记的抗黄曲霉毒素单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.4mL 0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，；在搅拌的状态下缓慢加入1.5mL 0.1mg/mL的抗黄曲霉毒素单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清蛋白水溶液至卵清蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；所述纳米金标记的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.45mL 0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH值，；在搅拌的状态下缓慢加入1.5mL 0.1mg/mL的抗杂色曲霉毒素单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清蛋白水溶液至卵清蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；所述纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mL 0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH；在搅拌的状态下缓慢加入2mL 0.1mg/mL的抗环匹阿尼酸单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清蛋白水溶液至卵清蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用。所述的标记洗涤保存液为：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。 9.权利要求1所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析纸条的应用，其特征在于：应用方法如下：将样品经甲醇提取，获得待测提取液，将待测提取液用水稀释，使稀释液中甲醇的终体积浓度为20～30％，得到待测样品溶液；再取该待测样品溶液作为检测液逐滴加入到所述的同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条的样品垫上进行检测，其作为检测试纸条，另取等体积的甲醇浓度一致的甲醇水溶液做为阴性对照液，逐滴加入另一同步检测黄曲霉菌真菌毒素的胶体金免疫分析试纸条的样品垫上，其作为对照试纸条，一段时间后将检测试纸条和对照试纸条进行显色对照：当检测试纸条上包被黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白偶联物的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素含量低于0.25ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素含量等于或高于0.25ng/mL并低于1ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中黄曲霉毒素的含量等于或高于1ng/mL；当检测试纸条上包被杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白偶联物的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中杂色曲霉毒素含量低于0.5ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中杂色曲霉毒素含量等于或高于0.5ng/mL并低于2ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中杂色曲霉毒素的含量等于或高于2ng/mL；当检测试纸条上包被环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的检测线颜色与对照试纸条上对应检测线的颜色接近时，表明待测样品溶液中环匹阿尼酸含量低于1ng/mL；比对应检测线的颜色浅时，表明待测样品溶液中环匹阿尼酸含量等于或高于1ng/mL并低于5ng/mL；不显色时，表明待测样品溶液中环匹阿尼酸的含量等于或高于5ng/mL；当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线是否显色，该试纸条判为无效；最后经换算即得待测样品中黄曲霉毒素、杂色曲霉毒素和环匹阿尼酸的含量。 10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的甲醇提取为：将待测样品磨细，加入体积浓度为70％的甲醇水溶液，混匀，涡旋震荡提取，离心取上清即待测提取液；所述的待测样品溶液的用量为80-150μL，检测时间为15-20分钟。
所属类别：	发明专利