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原文传递三重同时检测镰刀菌毒素的胶体金免疫层析试纸条、其制备方法和应用

专利名称：	三重同时检测镰刀菌毒素的胶体金免疫层析试纸条、其制备方法和应用
摘要：	本发明公开了三重同时检测镰刀菌毒素的胶体金免疫层析试纸条、其制备方法和应用，包括：将分别包被有ZEN‑BSA、DON‑BSA、FB1‑BSA的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线的硝酸纤维素膜、喷涂有FB1、DON、ZEN的单克隆抗体‑胶体金颗粒标记物混合物的结合垫、样品垫和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，组装后切小条得到。本发明将三种镰刀菌毒素的检测整合在一个试纸条上，形成的多通道检测效率高，且所得试纸条特异性好、灵敏度高，操作简单，非专业人员也可使用，满足粮食储存销售机构、出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等快速准确地判断FB1、DON和ZEN毒素具体含量的要求，便于基层推广和运用。
专利类型：	发明专利
申请人：	上海交通大学
发明人：	严亚贤;侯思露;孙建和
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T16:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T12:00:00+0805
申请号：	CN202010044913.9
公开号：	CN111141903A
代理机构：	上海伯瑞杰知识产权代理有限公司
代理人：	周一新;胡永宏
分类号：	G01N33/558;G01N33/577;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/558;G01N33/577
申请人地址：	200240 上海市闵行区东川路800号
主权项：	1.三重同时检测镰刀菌毒素的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，该试纸条由下到上依次包括底板、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水垫；其中：所述三重同时检测的镰刀菌毒素为伏马菌素B1(FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)；所述硝酸纤维素膜按照水平方向依次喷涂包被有羊抗鼠IgG抗体作为控制线和ZEN-BSA、DON-BSA、FB1-BSA的各条检测线；所述金标垫喷涂有由FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-胶体金颗粒标记物按比例混合均匀后的混合物，且喷涂量为10～14μL/cm。 2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述胶体金颗粒的平均粒径为25～30nm。 3.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度为4mm，和/或所述各条检测线和所述控制线之间间隔3.5～4mm。 4.权利要求1至3任一项所述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴合成胶体金颗粒，并分别制备FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-胶体金颗粒标记物； (2)预处理样品垫和金标垫，并将上述三种金颗粒标记物按比例混合均匀后喷涂至预处理后的金标垫上，喷涂量为10～14μL/cm，于37℃真空干燥； (3)在硝酸纤维素膜上按照水平顺序分别喷涂包被ZEN-BSA、DON-BSA、FB1-BSA的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线，于37℃真空干燥； (4)将步骤(3)干燥后的硝酸纤维素膜、步骤(2)干燥后的金标垫、处理后的样品垫和吸水垫按顺序依次粘贴于所述底板上，组装后切小条得到。 5.根据权利要求4所述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤⑴中，所述胶体金颗粒的制备方法包括：将100mL的0.01wt.％HAuCl4溶液加热至沸腾后迅速加入2～2.5mL的1wt.％柠檬酸三钠溶液，搅拌煮沸15min，冷却后加超纯水定容至100mL，得到胶体金溶液；和所述单克隆抗体-胶体金颗粒标记物的制备方法包括： ①向上述胶体金溶液中加入0.1mol/LK2CO3调节其pH为5.5～7.5； ②向调节过pH的胶体金溶液中分别加入FB1、DON和ZEN单克隆抗体，使其终浓度分别为4ug/mL、4ug/mL和5ug/mL，混合均匀后于37℃静置孵育30min； ③加入10％BSA至其终浓度为0.1％，混匀后于37℃孵育15min； ④12000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬于含4％蔗糖、6％海藻糖、1％BSA和0.05％叠氮钠的金标抗体储液中。 6.根据权利要求4所述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述金标垫的预处理方法为：将金标垫于含质量浓度分别为6％海藻糖、1％BSA和0.5％Tetronic1307的20mM pH7.4的硼酸盐缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h；和/或所述样品垫的预处理方法为：将样品垫于含质量浓度分别为6％海藻糖、1％BSA、0.05％Tetronic1307和0.05％叠氮钠的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h。 7.根据权利要求4所述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述FB1-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠IgG抗体的浓度均为50～500μg/mL，喷涂量均为0.75μL/cm。 8.权利要求1至3任一项所述胶体金免疫层析试纸条同时检测镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的方法，其特征在于，包括以下步骤： (ⅰ)5g待测样品加入20mL甲醇和水体积比为7：3的萃取液内，于摇床中剧烈震荡30min，静置30min，上清液于6000rpm离心10min，所得上清用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，并用10mM PBS缓冲液稀释2.5倍，稀释液于12000rpm离心10min，收集上清，得到样品液； (ⅱ)取100μL处理后的样品液滴在权利要求1至3任一项所述胶体金免疫层析试纸条的样品垫上，15min后观察所述硝酸纤维素膜上各条线的显色结果；其中，FB1的检测限为60ng/mL，和 DON的检测限为12.5ng/mL，和 ZEN的检测限为6ng/mL。 9.权利要求1至3任一项所述胶体金免疫层析试纸条在同时检测谷物中镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的用途。 10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，权利要求1至3任一项所述胶体金免疫层析试纸条同时检测小麦中FB1、DON和ZEN的cut-off值分别为600μg/kg、125μg/kg和60μg/kg。
所属类别：	发明专利