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原文传递三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用

专利名称：	三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用
摘要：	本发明公开了三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条、其制备方法和应用，包括：将分别包被有ZEN‑BSA、DON‑BSA、FB1‑BSA的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线的硝酸纤维素膜、喷涂有FB1、DON、ZEN的单克隆抗体‑荧光微球标记物混合物的结合垫、样品垫和吸水垫按顺序依次粘贴于底板上，组装后切小条得到。本发明将三种镰刀菌毒素的检测整合在一个试纸条上，形成的多通道检测效率高，且所得试纸条特异性好、灵敏度高，操作简单，非专业人员也可使用，满足粮食储存销售机构、出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等快速准确地判断FB1、DON和ZEN毒素具体含量的要求，便于基层推广和运用。
专利类型：	发明专利
申请人：	上海交通大学
发明人：	严亚贤;侯思露;孙建和
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T16:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T01:00:00+0805
申请号：	CN202010045027.8
公开号：	CN111089956A
代理机构：	上海伯瑞杰知识产权代理有限公司
代理人：	周一新;胡永宏
分类号：	G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/543;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/533;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/543
申请人地址：	200240 上海市闵行区东川路800号
主权项：	1.三重定量检测镰刀菌毒素的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，由下到上依次包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水垫；其中：所述三重定量检测的镰刀菌毒素为伏马菌素B1(FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)；所述硝酸纤维素膜按水平方向依次喷涂包被有羊抗鼠IgG抗体作为控制线和ZEN-BSA、DON-BSA和FB1-BSA的各条检测线；所述结合垫喷涂有由FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物按比例混合均匀后的混合物，且喷涂量为2.5～3.5μL/cm。 2.根据权利要求1所述的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的直径为100nm，其激发波长和发射波长分别为365nm和610nm，紫外灯照射下肉眼观察其荧光颜色是红色，其由CdSe/ZnS量子点和生物相容性高分子聚苯乙烯马来酸酐共聚物通过自组装制备得到，且所述CdSe/ZnS量子点包裹于所述聚苯乙烯马来酸酐共聚物内，所述荧光微球表面带有羧基基团。 3.根据权利要求1所述的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于，所述试纸条的宽度为4mm。 4.权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： ⑴分别制备FB1、DON和ZEN的单克隆抗体-荧光微球标记物； ⑵预处理样品垫和结合垫，将步骤⑴中制备的三种单克隆抗体-荧光微球标记物按比例混匀后喷涂于所述结合垫上； ⑶在硝酸纤维素膜上分别喷涂包被ZEN-BSA、DON-BSA、FB1-BSA的检测线和羊抗鼠IgG抗体的控制线，于37℃真空干燥； ⑷将步骤(3)干燥后的硝酸纤维素膜、步骤(2)制备的结合垫、处理后的样品垫和吸水垫按顺序依次粘贴于所述底板上，组装后切小条得到。 5.根据权利要求4所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述FB1、DON和ZEN三种单克隆抗体-荧光微球标记物的制备方法为： a)分别将0.5～1μgFB1、DON或ZEN的单克隆抗体、10μg荧光微球和0.25μg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入至pH 6的磷酸盐缓冲盐溶液中，混匀，于37℃振荡孵育10～20min； b)加入10wt.％BSA于上述反应体系中至其终浓度为0.1wt.％，混匀，于37℃振荡孵育10～20min； c)12000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬于含0.9wt.％氯化钠、1wt.％BSA和0.09wt.％叠氮钠的储存液中，超声20s，于4℃保存。 6.根据权利要求4所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述结合垫的预处理方法为：将结合垫于含质量浓度分别为6％海藻糖、1％BSA、0.5％PvPk30、0.5％Tween20和0.5％Tetronic1307的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h；所述样品垫的预处理方法为：将样品垫于含质量浓度分别为6％海藻糖、1％BSA、0.05％Tetronic1307、0.5％PvP k30、0.5％Tween20和0.05％叠氮钠的10mM pH7.4的PBS缓冲液中浸泡30min，取出，60℃真空干燥2h。 7.根据权利要求4所述荧光微球免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述FB1-BSA、DON-BSA、ZEN-BSA和羊抗鼠IgG抗体的浓度均为50～500μg/mL，喷涂量为0.8μL/cm。 8.权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条同时定量检测镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的方法，其特征在于，包括如下步骤： (ⅰ)5g待测样品加入20mL甲醇和水体积比为6：4的萃取液内，于摇床中剧烈震荡30min，静置30min，上清液于6000rpm离心10min，所得上清用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，用含质量浓度分别为5％甲醇、0.5％PvPk30和0.5％Tween20的10mM PBS缓冲液稀释15倍，稀释液于12000rpm离心10min，收集上清，得到样品液； (ⅱ)取100μL处理后的样品液滴在权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条的样品垫上，25min后用荧光免疫层析仪读取所述硝酸纤维素膜上控制线和各检测线的荧光强度； (ⅲ)根据上述检测线与控制线荧光强度的比值F＝T/C计算F/Fo，再根据F/Fo值和标准曲线得出待测样品中真菌毒素浓度，其中： Fo为标准品浓度为0时的T/C值。 9.根据权利要求8所述的同时定量检测镰刀菌毒素的方法，其特征在于， FB1的检测浓度范围为2.295～69.867ng/mL，和 DON的检测浓度范围0.465～16.19ng/mL，和 ZEN的检测浓度范围为0.295～2.575ng/mL。 10.权利要求1至3任一项所述荧光微球免疫层析试纸条同时定量检测谷物中镰刀菌毒素FB1、DON和ZEN的应用。
所属类别：	发明专利