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原文传递一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用

专利名称：	一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用
摘要：	本发明公开了一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条及其制备方法和应用。试纸条包括底板，底板上贴有反应膜；反应膜的一端覆盖吸水垫，另一端依次覆盖结合垫和样品垫；反应膜的非覆盖面上沿横向设置有检测线和质控线；结合垫上喷涂有聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；检测线上包被有呕吐毒素完全抗原，质控线上包被有山羊抗鼠二抗抗体。本发明大大简化了标记步骤，提高了标记效率，缩短了检测时长，比胶体金物理吸附稳定性好，检测准确度和精密度高；批次间差异性小成本低；另外检测方法操作简单，整个检测过程仅需要8min，检出限100ppb，定量检测范围100ppb～5000ppb，灵敏度高和特异性强。
专利类型：	发明专利
申请人：	华南农业大学
发明人：	杨金易;王序;曾道平;苏晓娜;谭庶;卢迪莎;吴颖;许小炫
专利状态：	有效
申请日期：	1900-01-20T03:00:00+0805
发布日期：	1900-01-20T19:00:00+0805
申请号：	CN202010006115.7
公开号：	CN111175511A
代理机构：	广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：	李小婷
分类号：	G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/53;G;G01;G01N;G01N33;G01N33/58;G01N33/577;G01N33/558;G01N33/53
申请人地址：	510642 广东省广州市天河区五山路483号
主权项：	1.一种呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上贴有反应膜；反应膜的一端覆盖吸水垫，另一端依次覆盖结合垫和样品垫；所述反应膜的非覆盖面上沿横向设置有检测线和质控线；所述结合垫上喷涂有聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；所述检测线上包被有呕吐毒素完全抗原，所述质控线上包被有山羊抗鼠二抗抗体。 2.根据权利要求1所述的呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针，是将活化后的聚集诱导发光荧光微球与呕吐毒素单克隆抗体按体积比8～12：1偶联后，加入牛血清蛋白(BSA)作封闭液得到。 3.根据权利要求2所述的呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述聚集诱导发光荧光微球的活化方法为：向羧基化的聚集诱导发光荧光微球溶液中，加入由碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)组成的活化剂进行活化得到；所述羧基化的聚集诱导发光荧光微球溶液与EDC和NHS的体积比为1～3：3：4；所述聚集诱导发光荧光微球采用四联苯乙烯酸四甲酯制备而成。 4.根据权利要求1所述的呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述呕吐毒素完全抗原是：以式(I)所示化合物为呕吐毒素半抗原，与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素完全抗原；所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)或牛血清蛋白(BSA)；其中，呕吐毒素半抗原为式(I)所示化合物： 5.根据权利要求4所述的呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述呕吐毒素单克隆抗体是：以所述呕吐毒素完全抗原作为免疫原，去免疫动物发生特异性免疫反应后，获得呕吐毒素单克隆抗体。 6.根据权利要求4所述的呕吐毒素荧光免疫层析试纸条，其特征在于，所述呕吐毒素半抗原的制备方法如下：将呕吐毒素溶解于乙二醇二甲醚中，加入氢化钠将呕吐毒素的羧基活化后偶联上丁二酸酐，避免呕吐毒素4号位和5号位的羧基被取代，再利用3-溴丙酸甲酯取代呕吐毒素4号位和5号位羧基上的氢，再于碱性条件下还原丁二酸酐，即得。 7.权利要求1～6任一所述呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1.将呕吐毒素半抗原与载体蛋白偶联，得到呕吐毒素完全抗原；以该呕吐毒素完全抗原作为免疫原，去免疫动物发生特异性免疫反应后，获得呕吐毒素单克隆抗体； S2.采用EDC和NHS活化后的羧基化的聚集诱导发光荧光微球，对呕吐毒素单克隆抗体进行标记，加入牛血清蛋白(BSA)溶液进行封闭，得到聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针；然后将聚集诱导发光荧光微球标记的呕吐毒素单克隆抗体的荧光探针喷涂于结合垫上； S3.在反应膜的检测线位置包被呕吐毒素完全抗原，检测线包被浓度为0.6～1.4mg/mL；在反应膜的质控线位置包被山羊抗鼠二抗抗体，质控线包被浓度为1.6～2.4mg/mL； S4.在底板上依次搭接样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，即得。 8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，呕吐毒素单克隆抗体与聚集诱导发光荧光微球的质量体积比为1μg：6～14μL，于100～300rpm、24～26℃条件下进行偶联反应35～45min；所述BSA溶液的用量为16～24μL，浓度为16％～24％。 9.一种定性定量检测呕吐毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)定性检测在1～6任一所述呕吐毒素荧光免疫层析试纸条的样品结合垫上加入待测样本，反应5～8min后，观察试纸条检测线和质控线出现的荧光情况：检测线和质控线都显示荧光，则待测样本中呕吐毒素的含量小于100ppb，定性判断为阴性；检测线不显示，质控线显示，则检测样本中呕吐毒素含量大于或者等于100ppb，定性判断为阳性； (2)定量检测检测定性判断为阳性的试纸条的荧光强度，根据标准曲线得到检测样本中呕吐毒素的含量。 10.权利要求1～6任一所述呕吐毒素荧光免疫层析试纸条在检测或监测饲料或食品中呕吐毒素的含量或水平中的应用。
所属类别：	发明专利