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原文传递快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用

专利名称：	快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条、制备及其应用
摘要：	本发明公开了一种快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条、制备及其应用。其包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有环匹阿尼酸‑卵清蛋白偶联物，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体，所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201871的杂交瘤细胞株YTT‑2产生。该试纸条用于检测环匹阿尼酸，具有检测快速、操作简单、灵敏度高的特点。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	湖北;42
申请人：	中国农业科学院油料作物研究所
发明人：	李培武;张兆威;王督;张奇;张文
专利状态：	有效
申请日期：	2019-04-30T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-09T00:00:00+0800
申请号：	CN201910364421.5
公开号：	CN110108874A
代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司
代理人：	乔宇
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路2号
主权项：	1.快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条，其特征在于：包括底板，底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物，质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体，所述抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C201871的杂交瘤细胞株YTT-2产生。 2.根据权利要求1所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条，其特征在于：所述的吸水垫长16～18mm，宽2～4mm；检测垫长25～30mm，宽2～4mm；金标垫长6～9mm，宽2～4mm；样品垫长12～18mm，宽2～4mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述的吸水垫为吸水纸；所述的底板为纸板。 3.根据权利要求1所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条，其特征在于：所述检测垫上的检测线与硝酸纤维素膜上沿的间距为15～20mm，质控线和检测线的间距为5～10mm。 4.根据权利要求1所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条，其特征在于：所述检测垫上每厘米检测线所需的环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng；每厘米质控线所需的兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng。 5.根据权利要求1所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析试纸条，其特征在于：所述金标垫中所用的纳米金的粒径为15～20nm；所述金标垫上每厘米喷涂长度所需的纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体的用量为100～200ng。 6.权利要求1所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)吸水垫的制备将吸水纸剪裁得吸水垫； (2)检测垫的制备检测线的包被：将环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物用包被缓冲液配制成0.1～0.5mg/mL的包被液；于距离硝酸纤维素膜上沿为15～20mm的位置，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，每厘米检测线上所需环匹阿尼酸-卵清蛋白偶联物的包被量为80～400ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟；质控线的包被：将兔抗鼠多克隆抗体用包被缓冲液配制成0.5mg/mL的包被液；于距检测线5～10mm的位置，用线喷方式将包被液横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米质控线上所需兔抗鼠多克隆抗体的包被量为100～300ng，然后于37～40℃条件下干燥60～120分钟； (3)样品垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存； (4)金标垫的制备将玻璃纤维膜放入封闭液中浸湿，取出，于37～40℃条件下干燥10～16小时，于已干燥的玻璃纤维膜上，用点喷方式将纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体溶液横向进行喷涂，每厘米喷涂长度所需纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体为100～200ng，然后真空冷冻干燥2～6h，置干燥器中室温保存；所述的抗环匹阿尼酸单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO:C201871的杂交瘤细胞株YTT-2产生； (5)试纸条的组装在底板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，即得快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条。 7.根据权利要求6所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的制备方法，其特征在于：所述检测线包被中所使用的包被缓冲液是按照下述方法配制得到的：1g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述的质控线的包被中所使用的包被缓冲液为:1g卵清蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得；所述的封闭液是按照下述方法配置得到的：将1～2g卵清蛋白，2～5g蔗糖，0.02～0.05g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL所得。 8.根据权利要求6所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的制备方法，其特征在于：所述纳米金标记的抗环匹阿尼酸单克隆抗体溶液是采用不饱和标记法制备的，其具体方法为：取50.0mL质量浓度为0.01％的纳米金溶液，用0.1mL 0.1mol/L碳酸钾水溶液调节pH；在搅拌的状态下缓慢加入2mL 0.1mg/mL的抗环匹阿尼酸单克隆抗体水溶液，继续搅拌30min；加入质量浓度为10％卵清蛋白水溶液至卵清蛋白的终质量浓度为1％，继续搅拌30min；于4℃放置2h后，3000r/min离心15min，取上清液，弃沉淀；将上清液12000r/min离心30min，弃去上清液，加入50.0mL标记洗涤保存液；再以12000r/min离心30min，弃去上清液，将沉淀用标记洗涤保存液重悬，得到5.0mL浓缩物，置4℃冰箱备用；所述的标记洗涤保存液是按照下述方法配制得到的：2.0g聚乙二醇-20000，0.2g叠氮钠，0.1235g硼酸，纯水定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤所得。 9.权利要求1所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的应用，其特征在于：应用方法如下：将样品经甲醇提取，获得甲醇提取液，将甲醇提取液用水稀释，使稀释液中甲醇的终浓度为20～30％，得到样品溶液，取稀释好的样品溶液作为检测液逐滴加入一快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的样品垫，将其作为检测试纸条，同时取等体积的甲醇水作为阴性对照液，逐滴加入另一快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的样品垫，将其作为对照试纸条，一段时间后读取结果；检测结果：阳性：当检测试纸条的质控线显示出红色线条，而检测线不显色时，表明待测样品中的环匹阿尼酸的总含量高于或等于5ng/mL；当质控线显示出红色线条，而检测线颜色比对照试纸条检测线颜色浅时，表明待测样品溶液中环匹阿尼酸含量等于或高于1ng/mL并低于5ng/mL；阴性：当检测试纸条的质控线显示出红色线条，并且检测线颜色与对照试纸条检测线颜色接近时，判为阴性结果，表明待测样品中的环匹阿尼酸的总含量低于1ng/mL；无效：当质控线不显色时，无论检测试纸条的检测线显示或不显示红色线条，该试纸条判为无效；最后经换算即得待测样品中环匹阿尼酸的含量。 10.根据权利要求9所述的快速检测环匹阿尼酸的胶体金免疫分析纸条的应用，其特征在于：所述的甲醇提取为：将待测样品磨细，加入体积浓度为70％的甲醇/2％NaHCO3水溶液，振荡提取，离心取上清，用正己烷萃取后收集下层水相，加入10％氯化钾溶液，并用HCl调节至pH 2-3，用氯仿振荡提取，收集下层氯仿层，旋转蒸发浓缩除去氯仿，将沉淀用甲醇溶解，获得甲醇提取液。
所属类别：	发明专利