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原文传递确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法

专利名称：	确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法
摘要：	本发明公开的一种多位点修饰修饰位点分析技术，实现了对4个及以上修饰位点的PEG化蛋白修饰位点定位，避免了对无法测准分子量的PEG修饰肽段的直接测定，而选择对PEG修饰肽段特异性回收并再次酶切后对不含被修饰位点的肽段进行精准的分子量测定，与理论肽段对比后得出准确的PEG修饰位点。本方法实现了对平均修饰度较高高的修饰位点较多的蛋白的修饰位点测定，对PEG修饰肽段具有特异性，简化检测步骤，减少工作量，操作方便，易于实施，重现率高。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	重庆;50
申请人：	重庆派金生物科技有限公司
发明人：	胡春兰;陈清;付志成;栾秋洋;范开
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-17T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-13T00:00:00+0800
申请号：	CN201910409771.9
公开号：	CN110118847A
代理机构：	重庆中之信知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：	廖天云
分类号：	G01N30/88(2006.01);G;G01;G01N;G01N30
申请人地址：	400700 重庆市北碚区丰和路106号
主权项：	1.一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于，包含如下步骤： (S1)对多位点PEG修饰蛋白质进行第一次酶切； (S2)分析与检测，确定修饰相关肽段； (S3)对修饰相关肽段进行回收和浓缩； (S4)再次进行分析与检测，确定修饰位点或进行二次酶切；第二次酶切使用至少一种与第一次酶切不同的工具酶； (S5)对S4步骤中二次酶切产物进行测定，识别因修饰导致的二次酶切过程中产生的特异性肽段，推断确定修饰位点。 2.如权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述多位点PEG修饰蛋白质包括至少4个修饰位点，所述修饰位点包括Lys氨基修饰位点和Cys氨基修饰位点。 3.如权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述S2步骤中为确定修饰相关肽段进行的分析与检测，包括采用LC-UV-ELSD和LC-MS的方法检测酶切是否完全和确证PEG修饰肽段的相对保留时间。 4.如权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述S3步骤中对修饰肽段进行回收的方法，为固定化的层析。 5.如权利要求4所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述层析为PEG抗体亲和层析。 6.如权利要求5所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述PEG抗体亲和层析使用的PEG抗体为IgM。 7.如权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述S4步骤对修饰位点确定，包括对S3步骤中回收的修饰相关肽段进行N端测序，确定修饰位点。 8.如权利要求1所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述第二次酶切使用多种工具酶时，先将样品分为若干份，再用不同的工具酶分别酶切。 9.如权利要求1-8任一项所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的方法，其特征在于：所述S1步骤中第一次酶切选用的工具酶包括胰蛋白酶、赖氨酸内肽酶、谷氨酸内肽酶、天冬氨酸酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶、Kex2中的一种；所述S4步骤中第二次酶切选用的工具酶包括胰蛋白酶、赖氨酸内肽酶、谷氨酸内肽酶、天冬氨酸酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶CPB、Arg-C、Kex2中的一种或多种。 10.如权利要求1-8任一项所述的一种确定多位点PEG修饰蛋白质修饰位点的分析方法，其特征在于：所述S5步骤对二次酶切产物测定方法包括液相色谱分析、质谱、紫外检测、示差折光检测、蒸发光散射检测，其中液相色谱分析包括反相层析、分子筛排阻层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析中的一种或几种。
所属类别：	发明专利