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原文传递一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用

专利名称：	一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用
摘要：	本发明属于荧光标记多糖技术领域，尤其涉及一种酸性多糖电泳标准品及其制备方法和应用，包括：1)透明质酸‑酪胺的合成：取8000、20‑40万、70‑90万三种分子量的透明质酸，分别溶解于碱性磷酸盐缓冲液中，溶解后分别加入酪胺Tyr反应，然后分别加入氰基硼氢化钠反应，完成后对反应液进行离心，取各自的上清液，得到三种透明质酸‑酪胺溶液；2)透明质酸‑酪胺‑FITC的合成：在步骤1)制备的三种透明质酸‑酪胺溶液中分别加入异硫氰酸荧光素，反应完成后，得到三种透明质酸‑酪胺‑FITC溶液。本发明采用FITC标记的不同分子量的透明质酸完全可以成为多糖标记中的Marker，能够快速检测多糖标记成功与否。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	山东大学
发明人：	宋淑亮;张娥;王宇;吉爱国
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-05T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910486681.X
公开号：	CN110132680A
代理机构：	济南圣达知识产权代理有限公司
代理人：	郑平
分类号：	G01N1/28(2006.01);G;G01;G01N;G01N1
申请人地址：	264209 山东省威海市文化西路180号
主权项：	1.一种酸性多糖电泳标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)透明质酸-酪胺的合成：8kDa、200-400kDa、700-900kDa三种分子量的透明质酸，分别溶解于碱性磷酸盐缓冲液中，溶解后分别加入酪胺Tyr反应，然后分别加入氰基硼氢化钠反应，完成后对反应液进行离心，取各自的上清液，得到三种透明质酸-酪胺溶液，备用； (2)透明质酸-酪胺-FITC的合成：在步骤(1)制备的三种透明质酸-酪胺溶液中分别加入异硫氰酸荧光素，反应完成后，得到三种透明质酸-酪胺-FITC溶液。 2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，步骤(1)中，所述碱性磷酸盐缓冲液的pH为7.0-7.8；优选地，步骤(1)中，所述酪胺Tyr的添加量为：透明质酸质量的3-4.5倍。 3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶解的条件为：在3-5℃下溶解10-14h；优选地，步骤(1)中，所述加入酪胺Tyr后的反应条件为：置于140-180r/min的摇床中，在35-40℃条件下反应22-25h。 4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氰基硼氢化钠的加入量为酪胺Tyr质量的0.5-0.8倍；优选地，步骤(1)中，所述加入氰基硼氢化钠后的反应条件为：置于140-180r/min的摇床中，在35-40℃条件下反应94-98h。 5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应条件为：在150-200r/min的摇床中，36-42℃条件下反应33-37h；优选地，步骤(2)中，所述异硫氰酸荧光素的加入比例为：所述异硫氰酸荧光素的加入比例为分子量8kDa的透明质酸质量的0.2-0.5倍。 6.如权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酸性多糖电泳标准品的制备方法还包括透明质酸-酪胺-FITC的纯化，包括如下步骤：分别对步骤(2)得到的三种透明质酸-酪胺-FITC溶液进行离心，取各自的上清液，对三种上清液分别进行超滤，脱除浓缩液中小分子物质，收集三种透明质酸-酪胺-FITC的浓缩液；进一步脱除小分子物质，收集第一峰，冻干，得纯品透明质酸-酪胺-FITC标准品，即酸性多糖电泳标准品。 7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，通过MiniKros Sampler mPES中空纤维膜过滤组件1-5kDa进行超滤，脱除浓缩液中分子量小于1kD的小分子物质；优选地，所述超滤的方法为：每次取10ml溶液稀释10倍体积，连续超滤次；优选地，所述进一步脱除小分子物质采用Superdex30。 8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法制备的透明质酸-酪胺-FITC标准品。 9.如权利要求8所述的所述透明质酸-酪胺-FITC标准品在多糖分子量测定中的应用，优选为在琼脂糖电泳法中的应用，所述三种分子量的透明质酸的质量比为1-1.5:0.9-1.1:0.8-1.2。 10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： S1、试剂配制： 1)电泳缓冲液：将巴比妥钠溶于纯水中，然后用盐酸调节pH值至8.5-9.0，即得； 2)琼脂糖溶液：将琼脂糖溶于步骤1)的电泳缓冲液，加热溶解； 3)Loading Buffer：医用甘油； 4)溴酚蓝：采用步骤1)的电泳缓冲液配制； 5)FITC溶液：采用步骤1)的电泳缓冲液配制； 6)透明质酸-酪胺-FITC Marker溶液：将所述三种透明质酸-酪胺-FITC混合后溶于电泳缓冲液中，即得； 7)按标记透明质酸相同方法标记聚甘露糖醛酸，将得到的荧光标记聚甘露糖醛酸溶于电泳缓冲液中，电泳待测； S2、琼脂糖电泳：将琼脂溶液静置，待琼脂糖凝胶凝固后转入电泳槽，接着加入电泳缓冲液并使液面没过胶面，然后依次加入溴酚蓝、FITC溶液、Marker溶液、荧光标记聚甘露糖醛酸溶液，电泳至溴酚蓝到达胶的底端，停止电泳，凝胶成像仪下观察凝胶，记录图像结果，即可。
所属类别：	发明专利