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原文传递一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用

专利名称：	一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用
摘要：	本发明提供了一种前列腺特异抗原的检测试剂盒、检测方法及应用，涉及抗原检测技术领域。本发明所述试剂盒及检测方法利用二抗修饰DNA，与抗原邻位连接形成Y型的抗原‑抗体‑DNA杂交链，作为信号转换器将抗原输入转换为DNA信号输出；同时将链替代反应和杂交链式反应联合，实现了信号的两级放大；长链DNA上每相邻的两端序列(发夹DNAH3和发夹DNA H4)组装形成镁离子DNA酶，在镁离子存在下该酶切割溶液当中的分子信标，断开的分子信标释放下来并发出荧光，新的分子信标又与镁离子DNA酶结合、被切割，循环放大荧光信号，实现第三轮的信号放大，大大提高了检测效率和灵敏度，使检测限达到0.73pg mL‑1。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	临沂大学
发明人：	张宁波;井文倩;刘静;周宏
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-27T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-06T00:00:00+0800
申请号：	CN201910566621.9
公开号：	CN110208538A
代理机构：	北京高沃律师事务所
代理人：	瞿晓晶
分类号：	G01N33/577(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	276005 山东省临沂市兰山区双岭路中段
主权项：	1.一种前列腺特异抗原的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：PSA抗体，琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯，三(2-羧乙基)膦，巯基修饰的DNA1，巯基修饰的DNA2，发夹DNA H1，发夹DNA H2，发夹DNA H3，发夹DNA H4，信标MB和Mg2+；所述巯基修饰的DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述巯基修饰的DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述发夹DNA H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述发夹DNA H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述发夹DNA H3的核苷6酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述发夹DNA H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述信标MB包含一个识别离子酶的rA碱基且修饰有FAM和BHQ基团。 2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述信标MB的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。 3.一种前列腺特异抗原的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将PSA抗体和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯进行偶联反应2h后，过滤得处理后抗体；所述PSA抗体和琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺)环已烷-1-1羟酸酯的摩尔比为1:10～20； (2)将巯基修饰的DNA1和巯基修饰的DNA2分别与三(2-羧乙基)膦进行羟基活化反应1h，得处理后DNA1和处理后DNA2；所述巯基修饰的DNA1和巯基修饰的DNA2与三(2-羧乙基)膦的摩尔比为1:104； (3)将所述处理后抗体分别与处理后DNA1和处理后DNA2在4℃孵育12h，得Ab1-DNA1和Ab2-DNA2；所述所述处理后抗体与处理后DNA1和处理后DNA2的体积比均为1:1； (4)将所述Ab1-DNA1、Ab2-DNA2、PSA、发夹DNA H1和发夹DNA H2混合后37℃反应2h，得链替代反应产物；所述Ab1-DNA1、Ab2-DNA2、PSA、发夹DNA H1和发夹DNA H2的摩尔比为100:100:100:10-3:10-3； (5)将所述链替代反应产物与发夹DNA H3和发夹DNA H4混合后37℃反应1h，得杂交链；所述发夹DNA H3和发夹DNA H4的摩尔比为300:10-3:10-3； (6)将所述杂交链与分子信标MB、Mg2+混匀后37℃反应1h，荧光检测；步骤(1)和步骤(2)之间并没有时间先后顺序限制。 4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤(1)所述反应在PBS缓冲溶液中进行，所述反应的温度为18～25℃。 5.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤(1)所述过滤用滤膜的截留分子量为10000MW。 6.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤(2)所述反应的温度为37℃。 7.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤(3)所述孵育后，还包括利用截留分子量为100000MW的滤膜过滤，保留膜上物质，并利用PBS缓冲液洗涤三次。 8.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤(3)得所述Ab1-DNA1和Ab2-DNA2后，还包括紫外吸收检测。 9.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，步骤(6)所述荧光检测为在520nm可见光下检测信号峰。 10.权利要求1或2所述检测试剂盒或权利要求3～9任一项所述检测方法在靶标抗原信号放大中的应用。
所属类别：	发明专利