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原文传递 CRP和SAA联合检测试剂盒及其制备方法

专利名称：	CRP和SAA联合检测试剂盒及其制备方法
摘要：	本发明提供一种CRP和SAA联合检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包含CRP和SAA联合检测试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线(CRP、SAA检测线)和1条质控线，样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合；所述结合垫包被有CRP和SAA抗体标记荧光微球。本发明采用荧光免疫层析法制备的试剂盒，可以同时检测CRP和SAA，提高了临床检测效率，具有高灵敏度、高特异性及快速检测的优点，为感染性疾病、组织损伤坏死性疾病等疾病的辅助诊断提供有效手段。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中生北控生物科技股份有限公司
发明人：	张勇
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-06T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201910371125.8
公开号：	CN110133281A
代理机构：	北京路浩知识产权代理有限公司
代理人：	王文君;黄爽
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	102200 北京市昌平区科技园区超前路27号
主权项：	1.CRP和SAA联合检测试纸条，其特征在于，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸收垫和底板，所述分析膜上设有2条检测线和1条质控线，所述样品垫、结合垫、分析膜和吸收垫依次搭接地粘贴在底板上且分别部分重合；其中，2条检测线靠近结合垫一端，质控线靠近吸水垫一端； 2条检测线分别为CRP检测线、SAA检测线；所述CRP检测线包被有CRP检测抗体，所述SAA检测线包被有SAA检测抗体；所述结合垫包被有CRP抗体标记荧光微球和SAA抗体标记荧光微球；所述检测线包被的抗体与所述结合垫包被的抗体分别具有不同的抗原结合位点。 2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；和/或所述结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜；和/或所述分析膜为硝酸纤维素膜；和/或所述底板的材质为PVC。 3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所用荧光微球是含有荧光物质的聚苯乙烯微球，所述荧光物质选自异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、TO、Cy3、Cy5、藻红蛋白、量子点中的至少一种；所述荧光微球的粒径为20nm～600nm，发射波长为500nm～700nm，荧光微球的使用浓度为0.00001mg/ml～0.1mg/ml；所述荧光微球的表面修饰有官能团，所述官能团选自羧基、氨基或醛基中的至少一种。 4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述CRP检测抗体为Abgree公司生产的抗体801001，所述SAA检测抗体为Medix Biochemica公司生产的抗体2203；和/或所述CRP抗体标记荧光微球中使用的CRP抗体为Abgree公司生产的抗体801002，所述SAA抗体标记荧光微球中使用的SAA抗体为Medix Biochemica公司生产的抗体2201；和/或所述质控线包被有二抗，所述二抗选自羊抗鼠、羊抗兔、兔抗羊抗体中的至少一种。 5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述CRP抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使CRP抗体与荧光微球上的官能团连接；和/或所述SAA抗体标记荧光微球是通过EDC和NHS使SAA抗体与荧光微球上的官能团连接。 6.根据权利要求1-5任一项所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条的长度为5～10cm，宽度为3～5mm。 7.CRP和SAA联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-6任一项所述的试纸条，任选包含用于装载所述试纸条的卡壳。 8.CRP和SAA联合检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)微球活化：向1mg/ml荧光微球1～5ml中加入用50mM，pH6.1 MES溶解的0.1～10mgEDC和10mg NHS，活化10～60min，7000～15000rpm离心30min，弃上清，沉淀用pH7.0～8.0的50mM PBS重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液；其中，所述荧光微球采用权利要求3中所述的荧光微球； (2)CRP抗体的偶联：将0.2mg CRP标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA的50mM PBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/ml CRP抗体标记荧光微球溶液；其中，所述CRP标记抗体为Abgree公司生产的抗体801002； (3)SAA抗体的偶联：将0.4mg SAA标记抗体加入1mg/ml活化的荧光微球溶液2ml中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含1％BSA的50mM PBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/ml SAA抗体标记荧光微球溶液；其中，所述SAA标记抗体为Medix Biochemica公司生产的抗体2201； (4)将步骤(2)和步骤(3)所得荧光微球溶液按体积比1:0.1～1:10混合； (5)结合垫的制备：以玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜作为结合垫，将步骤(4)制备的荧光微球混合液按0.25～1.5μL/cm喷涂在膜上，干燥备用； (6)分析膜的制备：将CRP检测抗体、SAA检测抗体和二抗稀释至0.8-1mg/ml，以0.8-1.2μL/cm的喷量喷涂在硝酸纤维素膜上，形成CRP检测线、SAA检测线和质控线，即为分析膜，干燥备用；其中，所述CRP检测抗体为Abgree公司生产的抗体801001，所述SAA检测抗体为MedixBiochemica公司生产的抗体2203，所述二抗为羊抗鼠IgG； (7)试纸条的组装：将样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫依次搭接地粘贴在PVC底板上且分别部分重合，裁切成长度为5～10cm，宽度为3～5mm的纸条，即得CRP和SAA联合检测试纸条；其中，所述样品垫为玻璃纤维素膜或聚酯纤维素膜。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)微球活化：向1mg/ml粒径为100nm发射波长为535nm的羧基荧光微球1ml中加入用50mM，pH6.1 MES溶解的1mg EDC和10mg NHS，活化30min，10000rpm离心30min弃上清，沉淀用pH7.4的50mM PBS重悬，得到1mg/ml活化的荧光微球溶液； (2)CRP抗体的偶联：将0.2mgCRP标记抗体加入2ml浓度为1mg/ml的活化荧光微球溶液中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含5mg BSA的50mM PBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/ml CRP抗体标记荧光微球溶液； (3)SAA抗体的偶联：将0.4mgSAA标记抗体加入2ml浓度为1mg/ml的活化荧光微球溶液中，室温混匀2～4h，10000rpm离心30min，弃上清，沉淀用含1％BSA的50mM PBS溶液封闭60min，搅拌混匀，10000rpm离心30min，收集的沉淀保存于pH7.8含0.5％BSA的20mM Tris缓冲液中，得到浓度为0.1mg/ml SAA抗体标记荧光微球溶液； (4)将步骤(2)和步骤(3)所得荧光微球溶液按体积比1:1混合； (5)结合垫的制备：以玻璃纤维膜作为结合垫，将步骤(4)制备的荧光微球混合液，用点膜仪以0.8μL/cm喷涂在预处理的玻璃纤维素膜上，干燥备用； (6)分析膜的制备：将CRP检测抗体、SAA检测抗体和二抗羊抗鼠IgG稀释至0.8mg/ml，以1μL/cm的喷量喷涂在硝酸纤维素膜上，分别形成CRP检测线、SAA检测线和质控线，即为分析膜，干燥备用； (7)试纸条的组装：将样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫依次搭接地粘贴在PVC底板上且分别部分重合，裁切成长度为8cm，宽度为4mm的纸条，即得CRP和SAA联合检测试纸条。 10.CRP和SAA联合检测试剂盒的制备方法，其特征在于，将权利要求1-6任一项所述试纸条，或按照权利要求8或9所述方法制备的试纸条装载于卡壳内，即得。
所属类别：	发明专利