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原文传递一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂及应用

专利名称：	一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
摘要：	本发明为一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂的制备及使用方法。将具有相同材料内核及不同发射波长的两种量子点分别与对链霉素和新霉素具有高特异性识别能力的适配体进行偶联，通过将该两种偶联物分别与氧化石墨烯构成荧光共振能量转移系统，可制备出对链霉素和新霉素多残留进行同时快速荧光检测的试剂。采用本发明检测试剂，可以不依赖于分离分析技术即实现对牛奶样品中链霉素和新霉素多残留的快速、准确和灵敏检测，为强化食品安全监管提供了强有力的技术保障。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏大学
发明人：	宋尚红;陈冠华;郭欣;高志飞
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-31T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910470326.3
公开号：	CN110221085A
分类号：	G01N33/94(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
主权项：	1.一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述试剂采用如下方法进行制备：将被分别用作新霉素和链霉素的信息传导试剂具有相同材料内核及不同发射波长的两种量子点QD2和QD1分别与对链霉素和新霉素具有高特异性和高亲和性的适配体进行偶联，通过将该两种偶联物分别与氧化石墨烯构成荧光共振能量转移系统，制备出对链霉素和新霉素多残留进行同时快速荧光检测的试剂；所述量子点QD1和QD2分别是以巯基乙酸和巯基丙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长分别为548和580nm；对链霉素具有高特异性和高亲和性的适配体SAPT的核酸序列为5'-NH2-(CH2)6-TAG GGA ATTCGT CGA CGG ATC CGC TCT GGG AGG TGC GGC TCT TTA CTC CTC CAA CGA CCC GGC TGCAGG TCG ACG CAT GCG CCG-3'；对新霉素具有高特异性和高亲和性的适配体NAPT的核酸序列为5'-NH2-(CH2)6-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC CGC GTG TAG TAG CCT GAC CAA GGCGCC CAC CTC GAT TTA GTC TGC AGG TCG ACG CAT GCG CCG-3'。 2.如权利要求1所述的一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述试剂制备方法的具体步骤如下：量取浓度分别为2.46×10-5和1.62×10-5mol/L的QD1和QD2各5μL，分别加入浓度为10g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10μL，用去离子水定容至40μL，分别进行活化；然后分别加入经变性处理的NAPT和SAPT，用pH7.4的磷酸盐缓冲液定容至400μL，进行偶联反应；将反应后溶液分别用50kD超滤管过滤，管中留存溶液分别用磷酸盐缓冲液定容至100μL，此SAPT-QD2和NAPT-QD1偶联物溶液构成链霉素和新霉素的复合荧光探针溶液，以QD2和QD1浓度计的偶联物浓度分别为810和1230nmol/L；将适量SAPT-QD2和NAPT-QD1混合后加入氧化石墨烯GO，并用磷酸盐缓冲液稀释至其中GO的浓度为300mg/L，以QD2和QD1浓度计的SAPT-QD2和NAPT-QD1的浓度分别为81和123nmol/L，猝灭反应30min后即构成可用于链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测的试剂SAPT-QD2/GO和NAPT-QD1/GO。 3.如权利要求1所述的一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述高特异性是指SAPT除链霉素外，对其它类别抗生素和氨基糖苷类抗生素，特别是对新霉素不具有识别作用，NAPT除新霉素外，对其它类别抗生素和氨基糖苷类抗生素，特别是对链霉素不具有识别作用；所述高亲和性体现为SAPT对链霉素的解离常数为26.56±6.57nmol/L，NAPT对新霉素的解离常数为40.96±11.56nmol/L。 4.如权利要求1所述的一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述量子点QD1是按如下步骤制备：将0.0760g碲粉与0.05g硼氢化钠置于带有注射器针头的小瓶中，加入2mL去离子水，立即通入氮气5min，停止通气后立即盖上瓶塞，常温下反应4h得到紫红色NaHTe溶液；将0.2200g氯化镉置于250mL三颈瓶中，加入100mL去离子水，通入氮气30min，然后加入206μL巯基乙酸，并用1mol/L NaOH调节pH至11.2，加入新制备的NaHTe溶液，于95℃下回流冷凝2h得到巯基乙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长548nm。 5.如权利要求1所述的一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述量子点QD2是按如下步骤制备：将0.1276g碲粉与0.0800g硼氢化钠置于带有注射器针头的小瓶中，加入3mL去离子水，立即通入氮气5min，停止通气后立即盖上瓶塞，常温下反应4h得到紫红色NaHTe溶液；将0.4567g氯化镉置于250mL三颈瓶中，加入100mL去离子水，通入氮气30min，然后加入420μL巯基丙酸，并用1mol/L NaOH调节pH至10，加入新制备的NaHTe溶液，将其转移至具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于160℃烘箱中加热1h得到巯基丙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长580nm。 6.如权利要求2所述的一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述活化是指在超声振荡下使QD1和QD2分别与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应3.95-4.05min和14.95-15.05min，在此时间范围以外都将导致量子点荧光强度降低；所述变性反应是指将NAPT和SAPT分别在95℃下加热10min，然后冰浴10min；所述偶联反应是指按照NAPT:QD1摩尔比1:3.8-4.2和SAPT:QD2摩尔比1:4.8-5.2的比例使NAPT和SAPT分别与活化后的QD1和QD2避光反应2h，在此比例范围内，QD1和QD2的表面都能够分别被NAPT和SAPT充分偶联；所述两种复合荧光探针NAPT-QD1和SAPT-QD2的激发波长为370nm，发射波长分别为550和586nm；所述猝灭反应是指GO通过π-π堆积相互作用分别与QD1和QD2构成荧光共振能量转移系统，使QD1和QD2的荧光猝灭。 7.如权利要求1所述的一种链霉素和新霉素多残留同时快速荧光检测试剂的使用方法，其特征在于按照下述步骤进行： (1)量取100μL上述荧光检测试剂，加入1μL链霉素和新霉素混合标准溶液或样品溶液，反应30min以上，低于此时间将导致猝灭的量子点荧光不能充分恢复，影响检测准确度； (2)将反应后的溶液放入酶标仪进行荧光测定。 8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述链霉素和新霉素混合标准溶液中链霉素和新霉素的浓度分别为10、50，50、100，100、200，500、500，800、800，1000、1000μg/L。 9.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述样品溶液按照下述步骤制备： (1)量取10mL空白牛奶，即没有链霉素和新霉素残留的牛奶，加入不同浓度链霉素和新霉素的混合标准溶液； (2)加入2mL15％(V/V)三氯乙酸，超声振荡20min，12000r/min离心10min，收集上清液，用去离子水定容至5mL。 10.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述在酶标仪中进行的荧光检测按照下述步骤进行： (1)新霉素和链霉素检测的激发波长370nm；发射波长550和586nm，对应的荧光强度为F550nm和F586nm；校正波长618和518nm，对应的荧光强度为F618nm和F518nm；新霉素和链霉素的净分析信号分别为ΔF1＝F550nm-F618nm，ΔF2＝F586nm-F518nm； (2)测量各标准溶液的ΔF1和ΔF2，对这些测得值和各标准溶液中的新霉素浓度CN以及链霉素浓度CS利用origin软件进行回归，可得到新霉素和链霉素的标准曲线ΔF1＝A1×CN+B1，ΔF2＝A2×CS+B2，其中A1、A2和B1、B2分别为回归过程中给出的斜率和截距； (3)测量样品溶液的ΔF1和ΔF2，代入各自标准曲线方程，计算样品中新霉素和链霉素的浓度。
所属类别：	发明专利