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原文传递氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用

专利名称：	氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂及应用
摘要：	本发明为一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂的制备及使用方法。将具有相同材料内核及不同发射波长的3种量子点分别与对卡那霉素、奈替米星和妥布霉素具有高特异性识别能力的适配体进行偶联，通过将该3种偶联物分别与氧化石墨烯构成荧光共振能量转移系统，可制备出对卡那霉素、奈替米星和妥布霉素多残留进行同时快速荧光检测的试剂。采用本发明检测试剂，可以不依赖于分离分析技术即实现对牛奶样品中卡那霉素、奈替米星和妥布霉素多残留的快速、准确和灵敏检测，为强化食品安全监管提供了强有力的技术保障。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	江苏;32
申请人：	江苏大学
发明人：	郭欣;陈冠华;宋尚红;高志飞
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-10-08T00:00:00+0800
申请号：	CN201910531434.7
公开号：	CN110308289A
分类号：	G01N33/94(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
主权项：	1.氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于：所述试剂采用如下方法进行制备：将对卡那霉素、奈替米星和妥布霉素分别具有高特异性和高亲和性的适配体作为其信息识别试剂，分别与作为其信息传导试剂的3种具有相同内核材料及不同发射波长的量子点QD1、QD2和QD3偶联，通过将该3种偶联物分别与氧化石墨烯GO构成荧光共振能量转移系统，制备出对卡那霉素、奈替米星和妥布霉素多残留进行同时快速荧光检测的试剂；所述量子点QD1、QD2和QD3分别是以巯基乙酸、巯基丙酸和巯基乙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长分别为548、580和668nm；对卡那霉素具有高特异性和高亲和性的适配体KAPT的核酸序列为5'-NH2-(CH2)6-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC CCC GCAATA AGA TTG GCG TAG TCT CTT ACG CAC TGA TAG TGC TGC GGC GCA TGC GTC GAC CTG-3'，对奈替米星具有高特异性和高亲和性的适配体NAPT的核酸序列为5'-NH2-(CH2)6-TAGGGA ATT CGT CGA CGG ATC CCA TGA CGC ATG TCG AAG CTT GGC GGC AGA CGT CCT TAGCTC TGC GGC GCA TGC GTC GAC CTG-3'，对妥布霉素具有高特异性和高亲和性的适配体TAPT的核酸序列为5'-NH2-(CH2)6-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC CAT CCT CGC TGA TGGGGG AGT TGC TAC CGG CCA TTC GTA TTC TGC GGC GCA TGC GTC GAC CTG-3'。 2.如权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于，所述试剂制备方法的具体步骤如下：量取浓度分别为21.11μmol/L、13.09μmol/L和6.01μmol/L的QD1、QD2和QD3各5μL，分别加入浓度为10g/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐10μL，用去离子水定容至40μL，分别进行活化；然后分别加入经变性处理的KAPT、NAPT和TAPT，用pH7.4的磷酸盐缓冲液定容至400μL，进行偶联反应；将反应后溶液分别用50kD超滤管过滤，管中留存溶液分别用磷酸盐缓冲液定容至100μL，此KAPT-QD1、NAPT-QD2和TAPT-QD3偶联物溶液构成卡那霉素、奈替米星和妥布霉素的复合荧光探针溶液，以QD1、QD2和QD3浓度计的偶联物浓度分别为1055.5、654.5和300.5nmol/L；将适量KAPT-QD1、NAPT-QD2和TAPT-QD3混合后加入氧化石墨烯(GO)，并用磷酸盐缓冲液稀释至其中GO的浓度为250mg/L，以QD1、QD2和QD3浓度计的KAPT-QD1、NAPT-QD2和TAPT-QD3的浓度分别为105.55nmol/L、65.45nmol/L和30.05nmol/L，猝灭反应30min后即构成可用于卡那霉素、奈替米星和妥布霉素多残留同时快速荧光检测的试剂KAPT-QD1/GO、NAPT-QD2/GO和TAPT-QD3。 3.如权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于：所述高特异性是指KAPT除卡那霉素外，对其它类别抗生素和氨基糖苷类抗生素，特别是对奈替米星和妥布霉素不具有识别作用，NAPT除奈替米星外，对其它类别抗生素和氨基糖苷类抗生素，特别是对卡那霉素和妥布霉素不具有识别作用，TAPT除妥布霉素外，对其它类别抗生素和氨基糖苷类抗生素，特别是对卡那霉素和奈替米星不具有识别作用；所述高亲和性体现为KAPT对卡那霉素的解离常数为40.25±5.97nmol/L，NAPT对奈替米星的解离常数为51.54±10.43nmol/L，TAPT对妥布霉素的解离常数为52.92±19.09nmol/L。 4.如权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于：所述量子点QD1是按如下步骤制备：将0.0760g碲粉与0.05g硼氢化钠置于带有注射器针头的小瓶中，加入2mL去离子水，立即通入氮气5min，停止通气后立即盖上瓶塞，常温下反应4h得到紫红色NaHTe溶液；将0.2200g氯化镉置于250mL三颈瓶中，加入100mL去离子水，通入氮气30min，然后加入206μL巯基乙酸，并用1mol/L NaOH调节pH至11.2，加入新制备的NaHTe溶液，于95℃下回流冷凝2h得到巯基乙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长548nm。 5.如权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于：所述量子点QD2是按如下步骤制备：将0.1276g碲粉与0.0800g硼氢化钠置于带有注射器针头的小瓶中，加入3mL去离子水，立即通入氮气5min，停止通气后立即盖上瓶塞，常温下反应4h得到紫红色NaHTe溶液；将0.4567g氯化镉置于250mL三颈瓶中，加入100mL去离子水，通入氮气30min，然后加入420μL巯基丙酸，并用1mol/L NaOH调节pH至10，加入新制备的NaHTe溶液，将其转移至具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于160℃烘箱中加热1h得到巯基丙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长580nm。 6.如权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于：所述量子点QD3是按如下步骤制备：将0.1276g碲粉与0.0800g硼氢化钠置于带有注射器针头的小瓶中，加入3mL去离子水，立即通入氮气5min，停止通气后立即盖上瓶塞，常温下反应4h得到紫红色NaHTe溶液；将0.4567g氯化镉置于250mL三颈瓶中，加入100mL去离子水，通入氮气30min，然后加入420μL巯基乙酸，并用1mol/L NaOH调节pH至10，加入新制备的NaHTe溶液，将其转移至具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，于160℃烘箱中加热55min得到巯基乙酸修饰的CdTe量子点，激发波长370nm，发射波长668nm。 7.如权利要求2所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂，其特征在于：所述活化是指在超声振荡下使QD1、QD2和QD3分别与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐反应3.95-4.05、9.95-10.05和14.95-15.05min，在此时间范围以外都将导致量子点荧光强度降低；所述变性反应是指将KAPT、NAPT和TAPT分别在95℃下加热10min，然后冰浴10min；所述偶联反应是指按照KAPT:QD1摩尔比1:3.8-4.2、NAPT:QD2摩尔比1:4.8-5.2和TAPT:QD3摩尔比1:4.8-5.2的比例使KAPT、NAPT和TAPT分别与活化后的QD1、QD2和QD3避光反应2h，在此比例范围内，QD1、QD2和QD3的表面都能够分别被KAPT、NAPT和TAPT充分偶联；所述3种复合荧光探针KAPT-QD1、NAPT-QD2和TAPT-QD3的激发波长为370nm，发射波长分别为555、583和673nm；所述猝灭反应是指GO通过π-π堆积相互作用分别与QD1、QD2和QD3构成荧光共振能量转移系统，使QD1、QD2和QD3的荧光猝灭。 8.如权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素多残留同时快速荧光检测试剂的使用方法，其特征在于按照下述步骤进行： (1)量取100μL上述荧光检测试剂，加入1μL卡那霉素、奈替米星和妥布霉素混合标准溶液或样品溶液，反应35min以上，低于此时间将导致猝灭的量子点荧光不能充分恢复，影响检测准确度； (2)将反应后的溶液放入酶标仪进行荧光测定。 9.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述卡那霉素、奈替米星和妥布霉素混合标准溶液中卡那霉素、奈替米星和妥布霉素的浓度分别为1μg/L、1μg/L、10μg/L，5μg/L、5μg/L、50μg/L，10μg/L、10μg/L、100μg/L，15μg/L、15μg/L、200μg/L，20μg/L、20μg/L、500μg/L。 10.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述样品溶液按照下述步骤制备： (1)量取10mL空白牛奶，即没有卡那霉素、奈替米星和妥布霉素残留的牛奶，加入不同浓度卡那霉素、奈替米星和妥布霉素混合标准溶液； (2)加入2mL 15％(V/V)三氯乙酸，超声振荡20min，12000r/min离心10min，收集上清液，用去离子水定容至5mL。 11.如权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述在酶标仪中进行的荧光检测按照下述步骤进行： (1)卡那霉素、奈替米星和妥布霉素检测的激发波长370nm；发射波长555、583和673nm，对应的荧光强度为F555nm、F583nm和F673nm；校正波长607、526和736nm，对应的荧光强度为F607nm、F526nm和F736nm；卡那霉素、奈替米星和妥布霉素的净分析信号分别为ΔF1＝F555nm-F607nm，ΔF2＝F583nm-F526nm，ΔF3＝F673nm-F736nm； (2)测量各标准溶液的ΔF1、ΔF2和ΔF3，对这些测得值和各标准溶液中的卡那霉素浓度CK、奈替米星浓度CN以及妥布霉素浓度CT利用origin软件进行回归，可得到卡那霉素、奈替米星和妥布霉素的标准曲线ΔF1＝A1×CK+B1，ΔF2＝A2×CN+B2，ΔF3＝A3×CT+B3，其中A1、A2、A3和B1、B2、B3分别为回归过程中给出的斜率和截距； (3)测量样品溶液的ΔF1、ΔF2和ΔF3，代入各自标准曲线方程，计算样品中卡那霉素、奈替米星和妥布霉素的浓度。
所属类别：	发明专利