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原文传递一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法

专利名称：	一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法
摘要：	本发明涉及一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS‑免疫层析检测方法，其检测原理是以硝酸纤维素膜(Nitrocellulose membranes，NC)为载体，双层染料5，5′‑二硫代双(2‑硝基苯甲酸){5，5′‑dithiobis‑(2‑nitrobenzoic acid)，DTNB}标记Au@Ag纳米材料偶联检测抗体作为SERS探针，结合传统的免疫层析法(Immunochromatographic assay，ICA)建立新型的基于表面增强拉曼光谱的免疫层析技术(SERS‑ICA)，应用该技术检测了人IgM和肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)特异性IgM阳性血清标本。检测分为样品稀释、SERS探针的释放，抗原抗体反应、结果分析等过程。通过本发明可提高人IgM的检测灵敏度和肺支阳性血清标本的检出率，对于临床治疗具有重要的意义。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	北京;11
申请人：	中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
发明人：	王升启;贾小飞;肖瑞;汪崇文;荣振
专利状态：	有效
申请日期：	2018-02-02T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-16T00:00:00+0800
申请号：	CN201810104303.6
公开号：	CN110133255A
分类号：	G01N33/558(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	100850 北京市海淀区太平路27号二所六室
主权项：	1.一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法特征在于，包含以下检测步骤： (1)双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备，包括：Au@Ag纳米材料、拉曼分子、检测抗体； (2)用划膜仪将抗体或者抗原固定到硝酸纤维素膜的控制线(C线)和检测线(T线)； (3)SERS-免疫层析试纸条的制备：先将拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)喷涂到结合垫上，再将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在聚乙烯PVC底板上，切割成6×0.35cm规格后，成为一根SERS-免疫层析试纸条； (4)样品液的层析：在SERS-免疫层析试纸条的样品垫上滴加包含检测物的样品液，检测物与SERS探针形成免疫复合物，并被T线上的抗原或者抗体捕获； (5)检测结果读取：使用拉曼光谱仪检测试纸条T线区域的SERS信号，并根据检测信号判读结果。 2.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的Au@Ag纳米材料是通过Au NPs表面原位生长Ag壳合成Au@Ag核壳纳米材料，所述的拉曼分子是5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸){5，5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB}。 3.根据权利要求1和2所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料的合成和制备包括下列步骤：在100mL沸腾的0.01wt％的氯金酸溶液中加入1.5mL 1wt％的柠檬酸钠溶液，制备出35nm左右的Au NPs。DTNB加入到Au NPs溶液里至终浓度10μM，8000rpm离心8分钟除去多余的DTNB。0.5mL柠檬酸钠(1％，w/v)加入到50mL Au/DTNB NPs溶液中搅拌加热，1mL的硝酸银(1mM)逐滴加入，搅拌并且煮沸15分钟。 4.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备包括下列步骤：500μL Au/DTNB@Ag/DTNB NPs溶液与20μL新鲜配制的EDC/sulfo-NHS溶液(1mg/mL)混合，混合液震荡15分钟。5μL抗体(5mg/mL)和500μL BBS缓冲液(10mM，pH8.0)加入到上述溶液中，混合物室温震荡2小时以偶联抗体。 5.根据权利要求1所述的SERS-免疫层析快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的方法建立，其特征在于：步骤(1)所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)的制备中，偶联羊抗人IgM的SERS探针用于检测人IgM；偶联鼠抗人IgM(μ链)的SERS探针用于检测人血清中的肺支特异性IgM抗体。 6.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的双层拉曼分子标记Au@Ag纳米材料-抗体复合物(SERS探针)保存在含有1％BSA(w/v)，0.1％PVP(w/v)，0.5％Tween-20(v/v)和10％蔗糖(w/v)的50mM Tris-HCl(pH8.0)复融液中。 7.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(2)中硝酸纤维素膜的C线和T线分别固定驴抗羊IgG和羊抗人IgM，用于检测样品中的人IgM；硝酸纤维素膜的C线和T线分别固定羊抗鼠IgG和MP P1抗原，用于检测人血清中的肺支特异性IgM抗体。 8.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(4)中的样品稀释液1×PBST用于稀释人IgM，2％氯化钠溶液用于稀释临床血清标本。 9.根据权利要求1所述的一种快速和高灵敏检测肺炎支原体感染的SERS-免疫层析检测方法，其特征在于：步骤(5)中所述的信号采集，其功率10毫瓦，信号采集时间5秒，沿T线位置选取均匀分布的5个点进行信号采集，在检测仪器上通过软件在1335cm-1波段时读取峰值，在检测人IgM时，峰值越高表明人IgM浓度越高；在检测临床血清标本时，通过计算肺支阴性血清的拉曼峰值得到一个临界值，峰值强于临界值的血清标本为肺支阳性，低于临界值的血清标本为肺支阴性。
所属类别：	发明专利