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原文传递一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法

专利名称：	一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法
摘要：	本专利公开了一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法，涉及核酸检测领域。整合式装置是由磁板、纸电极芯片和粘贴膜构成的多层板状结构，通过滑动中间磁板的方式实现样本、纯化缓冲液和扩增试剂的连续引入，嵌入磁板中的FTA卡用来从细菌中提取核酸并作为后续等温反应的反应室。该方法利用这个整合式装置完成鼠伤寒沙门氏菌核酸提取、等温扩增和电化学检测的核酸检测步骤，避免了传统方法的繁琐复杂的操作步骤和对精密仪器的需求，快速、灵敏的实现了对蛋清、饮用水和牛奶样品中的鼠伤寒沙门氏菌的检测，具有快速、便捷、低成本、高效灵敏等分析性能，对食品安全安全分析具有潜在的应用价值。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	济南大学
发明人：	刘海云;何涛;高奕;于京华
专利状态：	有效
申请日期：	2019-07-03T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910595394.2
公开号：	CN110220951A
代理机构：	济南誉丰专利代理事务所(普通合伙企业)
代理人：	赵凤
分类号：	G01N27/26(2006.01);G;G01;G01N;G01N27
申请人地址：	250022 山东省济南市市中区南辛庄西路336号济南大学
主权项：	1.一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征是包括以下步骤：（1）装置的设计、制造该整合式检测装置设计为多层板状样式，核心结构分为上层样品板，中层滑动板和下层电极板，由磁板结合粘贴膜和纸电极芯片构建而成；上层板有三个直径5 mm的圆孔和一个2 mm深3 cm长的正方形槽，三个圆孔分别用于滴加食物样本、纯化缓冲液和扩增试剂，正方形槽用于放置印有碳电极和银电极的纸芯片；中层滑动板由一个可滑动的磁板和两条固定磁条组成，可滑动的磁板有一个直径5 mm的圆孔，圆孔中塞有直径5 mm的FTA圆盘（用于从食物样本中提取核酸），通过抽拉可滑动的磁板，使FTA圆盘与上层板的圆孔对齐，即可通过上层圆孔完成食物样本、纯化缓冲液和扩增试剂的滴加；下层板包含一个10 cm × 5 cm大小的吸收板和一个5 cm × 5 cm的磁板，在磁板上有一个2 mm深3 cm长的正方形槽，吸收板用于从FTA圆盘中吸收细胞裂解后的废物，正方形槽用于放置印有工作电极的纸芯片；利用磁板的吸引力和粘贴膜，构建了一个密闭的扩增反应室，以保证等温扩增反应在反应室中能顺利的进行；该装置的制造步骤如下：利用数字化切割机将磁板和粘贴膜切割为15cm × 5 cm大小、将Whatman纸切割为10 cm × 5 cm大小，并在磁板和粘贴膜的特定位置用打孔机打5 mm的圆孔；纸电极芯片的构建的具体步骤如下：利用蜡打印技术在色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150 ºC下2 min，未打印蜡的地方为亲水区，纸电极芯片的疏水屏障形状是由Adobe illustrator CS6软件设计的，利用丝网印刷银/氯化银参比电极，碳对电极和碳工作电极组成，此外，它还包含一个辅助区（直径7 mm）和一个工作区域（直径7 mm），在纸电极芯片的工作区域修饰Au纳米粒子的具体步骤如下：先将80 mL 蒸馏水加热至90 ℃，然后加入0.8 mL 质量分数为 1% 的氯金酸溶液继续加热至96 ℃ 保持1分钟，最后加入2.8 mL 质量分数为 1% 的柠檬酸钠，加热8分钟得到金种子溶液，取20 μL金种子溶液滴加在工作层亲水区域，静置晾干，重复三次，制备得到修饰了金纳米粒子的工作电极；将磁板、纸电极芯片和粘贴膜依次堆叠起来，挤压成型；（2）鼠伤寒沙门氏菌培养鼠伤寒沙门氏菌的培养步骤如下：将鼠伤寒沙门氏菌在Luria-Bertani（LB）平板上37℃过夜培养，然后，选取单个鼠伤寒沙门氏菌菌落刺破并在10 ml LB液体培养基中37℃过夜生长，同时以110 rpm摇晃；用紫外分光光度计测量细菌悬浮液在600 nm处的吸光度（OD600），来确定细菌的浓度；（3）利用整合装置监测食物中的鼠伤寒沙门氏菌将（2）中的细菌悬浮液用PBS缓冲液（pH 7.4）分别稀释1、10、100、500、1000倍，分别取10μL的稀释液加入90μL蛋清中，混合均匀；该装置主要通过滑动中间磁板来实现食物样本、纯化试剂和扩增试剂的添加，滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层板的样品孔对齐；取10μL加入了鼠伤寒沙门氏菌的蛋清，滴加到FTA圆盘上；室温干燥15 min，用于裂解鼠伤寒沙门氏菌和提取核酸；15 min后，滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层板的清洗孔对齐，滴加纯化缓冲液，清洗沙门氏菌的裂解废物；65 ℃加热5 min，干燥FTA圆盘；干燥后，继续滑动中间磁板，使FTA圆盘与上层板的试剂孔对齐，滴加等温扩增反应混合溶液；再次滑动中间磁板至白色标线露出，使FTA圆盘滑动至密闭的扩增反应室；将整个装置放置热板上65 ℃加热60 min，使等温扩增反应充分进行；60 min后，将装置从热板上去下，在冷却至室温后，将装置的碳电极、银电极和金电极连接至电化学工作站，用差分脉冲伏安法（DPV）测量并记录电流响应；测量参数如下：电位范围为 -0.3至 -0.1 V，调制幅度为0.05 V，脉冲宽度为0.05 s，样品宽度为0.0167 s；（4）食物中的鼠伤寒沙门氏菌检测线测定将步骤（3）中食物样本中的鼠伤寒沙门氏菌的浓度改为一系列浓度梯度，然后在同样的参数设定下进行电化学检测，通过蛋清中鼠伤寒沙门氏菌的不同浓度梯度下的电化学信号扫描曲线得到工作曲线，进而实现定量分析。 2.如权利要求1所述的一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征是步骤（3）中的食物样本为饮用水。 3.如权利要求1所述的一种利用整合式装置检测食物中的鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征是步骤（3）中的食物样本为牛奶。
所属类别：	发明专利