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原文传递人类肺干细胞的分选方法

专利名称：	人类肺干细胞的分选方法
摘要：	本发明涉及一种肺组织干细胞的分选方法，尤其是一种人类肺干细胞的分选方法。包括处理肺组织，抗体孵育以及流式分选等步骤，利用该方法分选人类肺干细胞可以直接对人类肺干细胞进行研究，首次解决了阻碍人类干细胞研究的难题。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	天津;12
申请人：	天津市海河医院
发明人：	陈怀永;吴琦;孙昕;李宽;张秋阳;武俊平;谢祎
专利状态：	有效
申请日期：	2018-09-19T00:00:00+0800
发布日期：	2019-08-20T00:00:00+0800
申请号：	CN201811091544.8
公开号：	CN110146700A
代理机构：	天津市三利专利商标代理有限公司
代理人：	杨欢
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	300352 天津市津南区双港镇津沽路
主权项：	1.一种人类肺干细胞的分选方法,其特征在于，包括下述步骤： 1)将肺组织剪成1cm3小块,使用HBSS清洗后，转移至有盖培养皿机械剁碎成肺靡，并转移至50ml离心管中； 2)将37℃Liberase TM加入到步骤1)得到的离心管中；添加比例为：每1cm3的肺组织添加10mL的Liberase TM工作液； 3)将步骤2)得到的离心管，放入混匀仪中，1000rpm，37℃，摇动45min；取出，移液管上下吹打至大块的组织分离开，继续放入混匀仪，1000rpm，37℃，摇动15min；确保制成单细胞悬浮液； 4)再次用10ml移液器上下吹打，利用多选择性细胞过滤器，过滤肺组织消化液；滤去胞外基质； 5)用50ml含有2％FBS的HBSS重悬步骤4)得到的肺组织消化液，4℃，400g，离心5分钟；倾倒或吸出上清液，用含有2％FBS的HBSS多次重悬肺组织细胞团； 6)倾倒或吸出上清液，用2-5mL红细胞裂解液重悬细胞团，在冰上孵育2分钟，期间温和振荡得到裂解液； 7)立即添加20mL含有2％FBS的HBSS，稀释裂解液；4℃，400g，离心5分钟，弃去上清，用移液管吸取1mL含有2％FBS的HBSS重悬细胞团，然后添加9mL含2％FBS的HBSS，总体积为10mL； 8)用70μM的过滤网，将细胞过滤到50mL离心管中，以滤掉红细胞膜；4℃，400g，离心5分钟，用含有2％FBS的HBSS重悬细胞；细胞计数； 9)抗体孵育；一抗7AAD PE-Cy5，Anti-Human CD326(EpCAM)PE-Cyanine7，Anti-CD271(NGF Receptor)PE，anti-human HTII孵育45分钟；二抗Anti-Human CD31(PECAM-1)Biotin，anti-human CD45 Biotin，孵育40分钟； 10)流式分选；排除7AAD阳性细胞，CD31阳性细胞，CD45阳性细胞；选择EpCAM阳性，HTII阳性，NGFR阴性为肺泡Ⅱ型细胞；选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阴性为Club细胞；选择选择EpCAM阳性，HTII阴性，NGFR阳性为基底细胞。 2.根据权利要求1所述的人类肺干细胞的分选方法,其特征在于，步骤2)中37℃Liberase TM的制备方法为：将Liberase TM溶解在HBSS中，制备0.25Wünsch U/ml的Liberase TM工作液，37℃孵育待用。
所属类别：	发明专利