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原文传递一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测试剂盒

专利名称：	一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测试剂盒
摘要：	本发明提供了一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以一株禽滑液囊支原体宁夏分离株经重叠PCR扩增出的主要膜抗原MSPB重组蛋白为包被抗原。本发明的试剂盒能够快速、特异、有效地检测禽滑液囊支原体，以监测鸡群中滑液囊支原体病的流行情况。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	宁夏;64
申请人：	宁夏大学
发明人：	李继东;何生虎;司朵朵;郭亚男;魏晓明;郭磊
专利状态：	有效
申请日期：	2019-05-28T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910449366.X
公开号：	CN110221065A
分类号：	G01N33/569(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	750021 宁夏回族自治区银川市西夏区贺兰山西路489号
主权项：	1.一种蛋白的制备：以禽滑液囊支原体宁夏分离株 NX-7的全基因组作为模板，利用设计合成的特异性引物进行重叠PCR扩增，回收扩增的PCR产物，将扩增的PCR产物、pET-30a表达载体先用BamHI与XhoI酶切后再连接，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化BL 21(DE3)感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物进行纯化，即得所述禽滑液囊支原体主要膜抗原MSPB蛋白, 所述引物对包括： MSPB-F1 5' GCCGGATCCATGAAAAATAA 3' MSPB-R1 5' GATTCATCTGTCCATTGGAATG 3' MSPB-F2 5' CATTCCAATGGACAGATGAATC 3' MSPB-R2 5' ATTTTTCTCTAGCTTTGGTCCAAG 3' MSPB-F3 5' CTTGGACCAAAGCTAGAGAAAAAT 3' MSPB-R3 5' ATAAACCCGTCCCAGTATAGTGT 3' MSPB-F4 5' ACACTATACTGGGACGGGTTTAT 3' MSPB-R4 5' CTTCTCGAGTTAATCTTCGTGAGT 3' 所述MSPB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 2.一种禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法的建立，其特征如下：以MSPB蛋白作为包被抗原包被酶标板，将待测血清样品经稀释后加入酶标板孵育，加入酶标二抗孵育后显色，测定反应后血清样品的OD值。 3.根据权利要求2所述的禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤： (1)包被：以MSPB蛋白为包被抗原，将其稀释后，加入96孔的ELISA孔板上，每孔100 μL，37℃孵育1 h 4℃过夜；每孔加入300 μL的洗涤液洗涤3次，洗完后将板拍干； (2)封闭：每孔加入100 μL封闭剂，37 ℃，封闭1 h；弃去孔中多余的封闭剂，用洗涤液洗涤3次，洗完后拍干； (3)加待检血清：每孔加入100 μL用样品稀释液稀释过的血清，37 ℃，孵育1 h；之后弃去孵育后孔中多余的血清，用洗涤液洗涤3次，洗完后拍干； (4)加二抗：每孔加入100 μL用样品稀释液稀释过的酶标二抗，37℃，孵育1h；之后，弃去孵育后孔中多余的酶标二抗，用洗涤液洗涤3次，洗完后拍干； (5)显色：每孔加入100 μL显色剂，37 ℃避光显色15 min； (6)终止：每孔加入50 μL终止液；反应终止后置于酶标仪中，在450 nm下，读取每个样品的OD值； (7)结果判定：待检血清OD值≥0.324时判定为禽滑液囊支原体抗体阳性，OD值＜0.324判定为阴性。 4.根据权利要求3所述的禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法，其特征在于：步骤(1)中，包被抗原用包被液稀释至1 μg/mL。 5.根据权利要求3所述的禽滑液囊支原体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述包被液为0.01 M、pH 9.6的碳酸盐缓冲液。 6.根据权利要求3所述的禽滑液囊支原体抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：待检血清用样品稀释液按照1∶256倍稀释。 7.根据权利要求3所述的禽滑液囊支原体抗体间接ELISA检测方法，其特征在于：所述酶标二抗为羊抗鸡IgG酶标二抗；酶标二抗用样品稀释液按1:3000倍稀释。 8.一种禽滑液囊支原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以MSPB蛋白作为ELISA酶标板的包被抗原。 9.根据权利要求8所述的禽滑液囊支原体抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：包被禽滑液囊支原体MSPB蛋白的酶标板、血清标准液、酶标记抗体、TMB底物显色液、样品稀释液、洗涤液和终止反应液。 10.根据权利要求9所述的禽滑液囊支原体抗体间接ELISA检测试剂盒，在禽滑液囊支原体抗体检测中的应用。
所属类别：	发明专利