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原文传递一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法

专利名称：	一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法
摘要：	本发明公开了一种牙鲆弹状病毒检测试纸及其制备方法。所述检测试纸包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫，所述样品垫和吸水垫分别在载体板的两端，金标垫一端位于样品垫的下方，金标垫上载有胶体金标记的抗牙鲆弹状病毒G蛋白单抗，由杂交瘤细胞株HIRRV‑G‑4D10（CCTCC NO：C201869）所分泌，硝酸纤维素膜上依次划有检测线和质控线，其中检测线靠近样品垫侧，质控线靠近吸水垫侧，检测线包被抗牙鲆弹状病毒M蛋白单抗HIRRV‑M‑1F9和HIRRV‑M‑4D10混合单抗，质控线包被羊抗鼠IgG。本发明能够对牙鲆弹状病毒进行特异性检测，具有快捷迅速、灵敏准确、受影响小、成本低廉等优点，不受专业人员的限制。
专利类型：	发明专利
国家地区组织代码：	山东;37
申请人：	中国海洋大学
发明人：	唐小千;战文斌;杨秋娟;绳秀珍;邢婧
专利状态：	有效
申请日期：	2019-06-04T00:00:00+0800
发布日期：	2019-09-10T00:00:00+0800
申请号：	CN201910481316.X
公开号：	CN110221077A
代理机构：	青岛海昊知识产权事务所有限公司
代理人：	王铎
分类号：	G01N33/68(2006.01);G;G01;G01N;G01N33
申请人地址：	266100 山东省青岛市崂山区松岭路238号
主权项：	1.一种牙鲆弹状病毒检测试纸，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫，所述样品垫和吸水垫分别位于载体板的两端，硝酸纤维素膜检测层位于所述载体板的中部，所述金标垫一端位于样品垫的下方，另一端位于硝酸纤维素膜的上方，其特征在于所述金标垫上载有胶体金标记的抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单抗HIRRV-G-4D10，所述硝酸纤维素膜上依次划有检测线和质控线，所述检测线靠近样品垫侧，质控线靠近吸水垫侧；所述检测线包被抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单抗HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合单抗，质控线包被羊抗鼠IgG，所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单抗HIRRV-G-4D10由名称为：杂交瘤细胞株HIRRV-G-4D10，保藏号为：CCTCC NO：C201869，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2018年3月29日的杂交瘤细胞分泌的。 2.如权利要求1所述的抗牙鲆弹状病毒检测试纸，其特征在于所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白单抗HIRRV-G-4D10能与分子量为60 kDa牙鲆弹状病毒蛋白条带发生特异性反应。 3.如权利要求1所述的抗牙鲆弹状病毒检测试纸，其特征在于所述抗牙鲆弹状病毒G蛋白单抗HIRRV-G-4D10具有牙鲆弹状病毒中和活性。 4.如权利要求1所述的牙鲆弹状病毒检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）单抗HIRRV-G-4D10、HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的制备：利用Trizol法提取弹状病毒总RNA反转后获得cDNA，以cDNA产物为模板，PCR扩增G基因片端（61-1524 nt）与M蛋白基因全长，分别连接pET-28a、pET-32a载体构建重组表达质粒pET-28a-G与pET-32a-M，将其导入感受态大肠杆菌后经诱导表达、亲和层析纯化获得重组G蛋白与M蛋白，以亲和纯化的重组G蛋白与M蛋白作为抗原免疫Balb/c小白鼠，采用细胞融合法制备杂交瘤细胞，利用免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗牙鲆弹状病毒G蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞HIRRV-G-4D10与抗牙鲆弹状病毒M蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10，采用常规方法扩大培养上述所得到的杂交瘤细胞株，腹腔注射BALB/c小鼠取腹水，采用辛酸-硫酸铵法进行纯化获得抗HIRRV的三种单抗；（2）金标垫的制备： ① 胶体金与金标抗体的制备：采用微波炉-柠檬酸三钠还原法制得颗粒大小为20-30nm的胶体金，用0.1mol/L碳酸钾溶液调节胶体金pH值为8.2，将HIRRV-G-4D10按照18μg/ml加入胶体金中，再加入稳定剂5%的BSA经离心纯化后用金标保存液悬起,即为金标单抗液体； ② 载有金标单抗的金标垫的制备：将制成的金标单抗液体喷涂到玻璃纤维上，冷冻干燥；（3）硝酸纤维素膜检测层的制备：将调整好浓度的单抗HIRRV-M-1F9和HIRRV-M-4D10的混合抗体和羊抗小鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜检测层上，分别作为检测线和质控线，晾干后封闭液中浸泡，37℃烘干备用；（4）牙鲆弹状病毒快速检测试纸条的制作：在载体板上依次贴上硝酸纤维素膜、吸水垫、金标垫和样品垫，进行切条，即成本发明试纸。
所属类别：	发明专利